一株降解纤维素放线菌的产纤维素酶基因克隆与表达

【背景】纤维素在自然界中储量丰富,但天然纤维素的难降解性成为广泛应用纤维素资源的壁垒,近年来利用微生物来降解纤维素成为热点研究。【目的】筛选分离得到一株具有降解纤维素功能的放线菌菌株Lb1,通过全基因组测序确定其产纤维素酶关键基因5676,对基因5676进行克隆转化,使其在大肠杆菌中进行表达。【方法】通过基因工程技术将产纤维素基因连接到表达质粒上并导入表达菌株,对其降解纤维素生成葡萄糖的能力进行探究。【结果】将Lb1菌株的16S rRNA基因进行比对,确定菌株Lb1属于链霉菌属,命名为Streptomyces sp. Lb1。成功构建出纤维素酶表达载体,并且导入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3),重组菌株的产纤维素酶能力大于空载菌株。【结论】通过基因工程技术成功克隆出产纤维素酶基因,从而表达纤维素酶,为今后利用微生物降解纤维素的大规模应用提供参考。     

三株高效秸秆纤维素降解真菌的筛选及其降解效果

【目的】利用多种筛选方法,获得高效秸秆纤维素降解真菌,并研究其秸秆纤维素的降解能力。【方法】采用滤纸片孔洞法、滤纸条降解法、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水解圈测定法、秸秆失重法、纤维素分解率测定法、胞外酶活测定法等常规秸秆纤维素降解菌的筛选方法。【结果】筛选到3株具有较强纤维素降解能力的真菌菌株,经初步鉴定菌株98MJ为草酸青霉(Penicillium oxalicum)、菌株W3为木霉(Trichoderma sp.)、菌株W4为扩张青霉(Penicillium expansum)。菌株W4具有非常强的秸秆纤维素降解能力,10d内对秸秆的降解率可达56.3%,对纤维素、半纤维素和木质素的分解率分别为59.06%、78.75%和33.79%。菌株W4的胞外纤维素酶活力在14.25-49.75U/mL之间。【结论】筛选获得3株高效秸秆纤维素降解真菌菌株,其中菌株W4的纤维素酶活高于已报道的菌株,是一株十分具有研究开发潜力的纤维素酶生产菌株。     

土壤和空气中纤维素酶高产菌株的筛选

目的:分别从土壤和空气中分离纤维素分解菌株,以提高纤维素利用率。方法:将分离得到的菌株进行纯培养,并用刚果红染色,找出能出现透明圈的菌株,测定透明圈直径与菌落直径比,筛选产纤维素酶的菌株。结果:通过对比,从分离到的6株菌株中选出产纤维素酶活力高的2株,并对其进行鉴定,初步确定一株为曲霉属真菌,一株为放线菌。结论:本研究为提高纤维素利用率提供了微生物资源,为相关后续研究提供了物质和实验基础。     

从海水环境分离筛选甘蔗渣纤维素降解菌

【目的】筛选海水环境高效甘蔗渣纤维素降解菌,并研究不同菌株间的混合发酵对甘蔗渣纤维素酶活力的影响,为纤维素降解菌在海水养殖中的应用提供理论基础。【方法】采用刚果红染色法进行菌株初筛,利用DNS法测定各菌株胞外纤维素酶活力及不同菌株间的混合酶液与混合发酵酶液的纤维素酶活力。【结果】筛选得到两株具有较强纤维素分解能力的细菌菌株Z4和S5,经16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。菌株S5具有最高的全酶活和甘蔗渣纤维素酶活,分别为1.16 U/mL和2.80 U/mL。菌株Z4与S5间混合发酵能明显提高菌株的纤维素酶活力,比S5单独发酵时全酶活、甘蔗渣纤维素酶活分别提高40.60%、14.21%。同时菌株S5与芽孢杆菌BZ5混合发酵也能提高其纤维素酶活力,比S5单独发酵时全酶活、甘蔗渣纤维素酶活分别提高6.23%、25.92%。【结论】筛选得到两株酶系较全且酶活较高的纤维素降解菌Z4、S5,适宜的混合发酵可明显提高纤维素降解能力,在海水养殖中有较大的应用前景。     

秸秆降解菌的筛选及其纤维素降解性能的研究

通过秸秆粉平板、刚果红染色法以及小麦秸秆降解率来筛选高效秸秆降解菌,并测定菌株的胞外纤维素酶活来研究其秸秆纤维素的降解能力。结果表明,在所筛选的4株真菌中,菌株z-5的秸秆降解率最高,为47%;其次是菌株4-1、3-1和2-2,分别为45%、32%和31%,滤纸腐解实验结果与秸秆降解试验结果相似。4株秸秆降解菌均具有外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等3种纤维素酶,但变化趋势不同。菌株z-5和菌株4-1的三种酶活呈现出较好的协同性,菌株2-2和菌株3-1协同性较弱。通过秸秆粉平板,秸秆降解率测定以及滤纸孔洞法可以更准确快速地得到目的菌株;纤维素酶在秸秆降解中起着主导作用。     

NH3和H2S降解功能菌的分离鉴定及降解特性研究

为了减少厨余垃圾堆放时恶臭气体的排放，本研究利用富集驯化、定性初筛和定量复筛法从厨余垃圾中分离筛选到2株对NH₃和H₂S均具有高效降解作用的菌株CN5和CS2。通过16S rDNA序列分析，分别鉴定为肠球菌属(Enterococcuss sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。通过单因素实验，确定两株菌的最佳除臭条件为:培养温度为35℃、pH为7、碳氮比25∶1、碳源为蔗糖、氮源为氯化铵，对NH3和H2S的降解率均能达到85%左右。菌株CN5和CS2在2∶3的混合状态下生长状况最好，p H值稳定，OD600最大值为1.342。通过氨氮含量和硫酸盐含量测定实验发现，最终氨氮含量为50.5 mg/L，菌剂对氨氮降解率为85.3%；硫酸盐含量为302.7 mg/L，菌剂对硫酸盐生成率为89.2%。结果表明，从厨余垃圾中筛选得到的2株菌对NH₃和H₂S具有良好的降解能力，且两菌株相互之间具有协同作用。     

筛选选择性降解玉米秸皮的菌株

目的:筛选能选择性降解玉米秸皮的菌株,用于玉米秸皮生物机械法制浆的研究。方法:采用Bavendamm-PDA平板对玉米种植地土壤内的真菌进行初筛选,之后采用玉米秸皮降解实验对产生棕色变色圈的菌株和实验室现有白腐菌进行复筛选。结果:筛选到4株能在Bavendamm-PDA平板上产生棕色变色圈的菌株;降解实验显示杂色云芝引起了最大31.76%的重量损失,重量损失最小的菌株为粗毛栓菌lg-9;除杂色云芝和白耙齿菌降低了玉米秸皮苯醇抽出物外,其他处理样均增加;碳水化合物测定结果表明白耙齿菌处理样综纤维素的损失最大,且各种菌株所引起的综纤维素损失中,纤维素和聚戊糖损失所占的比例有很大差别。结论:粗毛栓菌lg-9对玉米秸皮木素降解的选择性最强,之后为Sd、黄袍原毛平革菌-14和黄袍原毛平革菌-25。     

发酵床中纤维素降解菌的分离与鉴定

从发酵床垫料中初步分离出43株纤维素降解菌。采用刚果红鉴别培养基及滤纸条培养基初筛,得到5株透明圈较大且使滤纸条产生崩解的菌株,通过进一步液体发酵,测定其CMC酶活、FPA酶活和天然纤维素酶活,获得2株具有较高纤维素降解活性菌株,并分别命名为F7和F21。经16S rRNA基因序列分子生物学鉴定和系统发育分析表明,这2株纤维素降解菌分别归属为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链霉菌(Streptomyces sp.)。     

一株南海指海绵共附生真菌多样性及其抗菌活性

本研究通过采用6种不同的培养基对南海指海绵上的共附生真菌进行平板涂布法分离培养,结合ITS-rDNA基因序列特征和形态学特征进行鉴定来研究海绵共附生真菌多样性。共分离培养出55株(21种)真菌菌株,优势菌属为木霉菌属Trichoderma sp.(31株),其中的哈茨木霉Trichoderma harzianum 22株作为优势菌种,占真菌菌株总数的40%。其余真菌则属于枝孢菌属Cladosporium、迈耶氏酵母属Meyerozyma、茎点霉属Phoma、红酵母属Rhodotorula、青霉菌属Penicillium、曲霉属Aspergillus等10个属,还有两株未鉴定到种的子囊菌。选取金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus等7种病原指示菌,采用琼脂扩散法对21种真菌的代表性菌株进行抗菌活性筛选,其中有3种真菌至少对一种指示菌表现出抑菌效果,占菌株种类总数的11%。     

3株多环芳烃高效降解菌株的分离鉴定及降解特性

筛选分离降解多环芳烃(PAHs)的优势菌种对开展多环芳烃污染生态系统修复具有重要的现实意义。本研究以焦化厂周围受多环芳烃污染的土壤为菌源,经过富集培养驯化和平板分离,获得11株能降解多环芳烃的菌株。通过形态观察、生理生化特征及16S rRNA序列比对对菌株进行鉴定,筛选出3株PAHs高效降解菌,分别命名为DJ-3、DJ-8、DJ-10。经16S rRNA序列分析鉴定,DJ-3为假单胞菌属、DJ-8为克雷伯氏菌属、DJ-10为芽孢杆菌属。对菌株降解能力的研究表明,3株菌(DJ-3、DJ-8、DJ-10)培养7 d后对混合多环芳烃中菲(200 mg·L^-1)、芘(200 mg·L^-1)和萘(160 mg·L^-1)的降解率分别为48.9%～65.9%、38.9%～43.1%和57.6%～64.9%。3株菌对多环芳烃混合样品(1200 mg·L^-1)的降解率分别为49.1%、44.5%、53.9%,远高于其他8株筛选菌,为PAHs高效降解菌株。3种菌株两两之间和三者组合均无拮抗关系。研究结果将为构建高效的多环芳烃降解菌群、提高多环芳烃原位污染土壤的生物修复效果奠定基础。     

纤维素降解菌的分离筛选及对中药废弃物的固相发酵研究

中药在提取炮制后残留大量生物质被简单堆弃,而其中的木质纤维素等生物质能被微生物有效利用降解,筛选到16株对木质纤维素有降解效果的菌株,对其中8株降解效果明显功能菌株进行了深入研究,经16(18)S rDNA鉴定发现5株细菌主要为Bacillus属、Streptomyces属和Enterobacter属,3株真菌为Ascomycete属、Aspergillus属和Trichosporon属;利用8株菌固相发酵中药废弃物,通过监测堆体温度、pH等参数,发现细菌类在发酵初期能迅速提高堆体温度,而真菌类发酵腐熟过程较缓慢,提示利用细菌-真菌联合组成降解菌系是提高中药废弃物固相发酵的重要手段。     

硝磺草酮抗性菌株的筛选及抗性基因的克隆表达

【目的】从采集的土壤中筛选出硝磺草酮的抗性菌株,并从中克隆对羟苯基丙酮酸双加氧酶抗性基因。【方法】以酪氨酸为唯一碳源,采用富集培养法筛选分离硝磺草酮抗性菌株,利用16S rRNA基因序列分析对菌株进行初步鉴定。通过PCR扩增获得其HHPD基因序列,构建pETH4表达载体并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达。通过检测色素在440 nm处的吸收值分析菌株E. coli BL21(DE3)-pETH4对硝磺草酮的抗性特性。【结果】在含10 mmol/L硝磺草酮和1 g/L酪氨酸的选择培养基上,分离得到7株硝磺草酮抗性细菌,1株为不动杆菌属,2株为无色杆菌属,4株为假单胞菌属。从抗性最佳的Pseudomonas sp. AM-H4中扩增得到HPPD的基因片段为1 056 bp,其序列与Acinetobacter baumannii基因组中HPPD的基因序列相似性达到99%,341位点由天冬氨酸突变为丙氨酸。HPPD基因在大肠杆菌中实现异源表达,蛋白分子量大小约40 kD。菌株E. coli BL21(DE3)-pETH4在40 μmol/L硝磺草酮酪氨酸LB培养基中的色素吸收值显著降低,能够耐受高于200 μmol/L的硝磺草酮。【结论】克隆获得的HPPD具有良好的硝磺草酮抗性,将在新除草剂抗性作物选育中有一定的应用潜力。     

聚乙烯醇降解细菌筛选及其降解特性

从聚乙烯醇泡棉的堆肥降解过程中筛选出可以有效降解聚乙烯醇的菌株,并研究其对聚乙烯醇的降解效果和降解特性。将聚乙烯醇泡棉经过3年的堆肥降解,利用傅里叶转换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)检测泡棉的分子结构变化;采用Finley法从降解后的聚乙烯醇泡棉中筛选降解效果较好的菌株,通过菌落形态和细胞染色以及16S rRNA基因序列比对进行鉴定;通过紫外分光光度计检测菌株在降解聚乙烯醇材料过程中的菌体浓度变化和聚乙烯醇降解程度,并将筛选菌株对两种醇解度的聚乙烯醇降解效果进行对比。结果表明,经过3年的堆肥降解,聚乙烯醇泡棉分子结构中出现了新的羧基和羟基;筛选得到了四株菌,即Bacillus sp.DG01、Bacillus sp.DG02、Paenibacillus sp.DG03、Paenibacillus sp.DG04。这4株筛选菌株对3.0g/L PVA1788的降解率分别为67.27%、74.99%、56.74%和59.70%,对3.0 g/L PVA1799的降解率分别为58.27%、54.47%、43.32%和46.59%。PVA泡棉在堆肥降解过程中发生了明显的基团变化,4株菌的生长与聚乙烯醇的降解过程呈耦联关系,且4株菌株整体上对较低醇解度的PVA降解效果更好。     

棉铃虫人工饲料主要污染细菌鉴定及其抗生素筛选

棉铃虫的人工饲养是对其进行昆虫病原菌生物测定的重要步骤,而饲料污染是影响棉铃虫培养成功率的主要因素。因此,选择合适的抗生素对棉铃虫的饲养具有重要意义。为明确棉铃虫饲料中污染细菌的组成,筛选可抑制污染菌的抗生素,本研究以受污染棉铃虫饲料中分离出的9个菌株为实验材料,观察菌株形态。采用16S rDNA系统发育分析法构建进化树,同时根据药敏与生理生化实验,确定分离菌株的生理生化特性。结果表明,9个菌株共呈现5种生理生化特性,其中,2株与肠球菌属(Enterococcus sp.)接近,2株与埃希氏菌属(Escherichia sp.)接近,2株与志贺氏菌属(Shigella sp.)接近,2株与肠杆菌属(Enterobacter sp.)接近,1株与沙雷氏菌属(Sarratia sp.)接近。抗生素筛选实验结果显示,卡那霉素对于不同菌株的抑菌效果最好。这为提高棉铃虫人工饲养成活率具有重要意义。     

一株DDT降解菌的筛选、鉴定及降解特性的初步研究

从DDT污染的土壤中筛选具有DDT降解能力的细菌,经过富集培养、分离纯化得到56株细菌,将其接种到基础盐酵母培养基,7d后用紫外分光光度计法初筛得到降解率较高的一株菌,编号为D-1.通过16S rDNA序列分析结合传统分类学方法确定该菌为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)的一株茵.对菌体降解DDT的特性的研究表明,在培养温度为3℃,底物质量浓度为40 mg/L, pH 7.0,摇床转速为200 r/min的条件下,该菌株对DDT降解10d的降解率为69.0%.     

烤烟根际烟碱降解细菌的多样性及其促生特性分析

【背景】挖掘兼具烟碱降解和植物根际促生细菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria,PGPR)功能的细菌资源,有助于保护土壤质量,实现绿色种植。【目的】分析烤烟根际细菌多样性,筛选可降解高浓度烟碱的PGPR。【方法】采用纯培养法在选择性培养基上分离烟碱降解细菌。通过BOXA1R-PCR分析技术、16SrRNA基因测序及系统发育树构建,对菌株的遗传多样性和分类学地位进行分析。进一步评价了菌株的吲哚乙酸(Indole-3-Acetic Acid,IAA)活性、溶磷能力、病原菌拮抗能力等PGPR指标,以筛选出高效PGPR,最后通过盆栽试验验证其促生效果。【结果】分离得到58株烟碱降解细菌,根据BOXA1R-PCR指纹图谱选取11株菌进行16S rRNA基因序列测定,结果表明,58株菌分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拉乌尔菌属(Raoultella)和短波单胞菌属(Brevundimonas)4个属,以芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属。58株细菌中48.28%的菌株可产IAA,27.59%具备溶磷能力,37.93%具备纤维素降解能力,G2-13、G2-3及HT2-8因促生与抗病特性突出而被筛选为目标功能菌。盆栽试验结果表明,G2-13菌株对幼苗生长的促进作用明显,可使株高与地上部鲜重分别增加33.05%与53.32%。【结论】烤烟根际存在较为丰富多样的烟碱降解细菌,它们在种植业上具有潜在的应用价值。     

三株Pseudomonas sp.的吡啶降解多样性分析

目的:为了探讨3株Pseudomonas sp.对吡啶降解存在多样性.方法:基于16S rRNA和ISR序列分析,对3株分离菌株进行初步鉴定,进而通过Touch -Down PCR,对3株细菌降解吡啶的多样性进行分析.结果:3株细菌XJUHX -1、XJUHX - 12和XJUHX - 16初步鉴定为Pseudomonas,3株实验菌株的部分降解基因的扩增条带有差异.结论:同属的3株 Pseudomonas在吡啶降解上存在多样性.     

高环多环芳烃降解菌的筛选及其降解特性

通过富集培养及平板升华法从本溪钢铁公司周边多环芳烃(PAHs)污染土壤中分离出7株PAHs降解菌。以芘和苯并[a]芘为底物进行摇瓶降解实验,结果表明:G1、G2和G3菌株对高环PAHs芘和苯并[a]芘均具有较强的降解能力。进一步研究此3株菌及混合菌对原状污染土壤中PAHs的降解能力,发现80 d时对总PAHs的降解顺序依次为:混合菌G2G1G3,其中混合菌对PAHs降解率较单菌分别提高了9.17%、11.49%和16.11%;4个处理对4~6环PAHs的降解率较对照组相比提高的倍数随着环数增加而增大;总PAHs的降解率与脱氢酶的活性呈正相关。电场影响G1、G2和G3菌株对PAHs降解,在1.0 V·cm~(-1)电场条件下,4环、5环及6环PAHs降解率较单纯微生物修复提高12.13%、13.35%和14.52%,说明3株菌具有较强的电场适应能力,可在高环PAHs污染土壤的电动-微生物修复中应用。形态学观察及16S rRNA序列比对分析表明,G1、G2、G3菌株分别为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)、苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)和无色杆菌属(Achromobacter sp.)。     

产纤维素酶黏细菌在生物转化的作用

目的:预处理对木质纤维素降解的影响.方法:从土壤中分离筛选到高纤维素酶活的黏细菌菌株So ce sh1008.该菌具有CMC酶活(CMCase)及微晶纤维素酶活性.研究NaOH联合黏细菌降解盐蒿、稻草、棉花秸秆和甘蔗渣四种木质纤维素的情况.结果:碱(2％ NaOH) -黏细菌处理的方法优于黏细菌-碱的方法,其中降解棉花秸秆降解效果最明显,以5.0g木质纤维素为原料,其最终干重损失达2.1g,溶液中总糖含量和还原糖含量均值分别为12.8 mg/mL和0.93 mg/mL.酵母菌发酵产乙醇的研究结果表明,最佳发酵时间为47h,碱-黏细菌甘蔗渣降解液发酵效果最好,乙醇产出达6.0％.结论:黏细菌联合2％ NaOH能有效降解甘蔗渣,提高乙醇产量.     

磷酸三(1-氯-2-丙基)酯降解菌筛选及其降解特性

【背景】磷酸三(1-氯-2-丙基)酯[tris-(1-chloro-2-propyl)phosphate,TCIPP]作为全球广泛关注的新兴有机污染物,具有环境赋存含量高、不易生物降解等特点,亟须开发TCIPP的高效去除技术。【目的】获得具有较高TCIPP降解效率并可用于TCIPP污染修复的新菌株。【方法】利用梯度提高无机盐培养基中TCIPP浓度的方法,从TCIPP污染土壤中筛选出1株能够降解液体中高浓度TCIPP (100 mg/L)的菌株,根据16S rRNA基因序列分析对其进行鉴定,并首次对其降解液体中TCIPP的特性进行研究。【结果】所筛选的TCIPP降解菌株DT-6为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.),它能够利用TCIPP作为唯一碳源和能源;当TCIPP初始浓度为50 mg/L、培养时间为7 d时DT-6的生物量最大,对TCIPP的降解率也达到最高,为34.6%;蔗糖的加入能够显著促进DT-6的生长,但却抑制了其对TCIPP的降解。【结论】本研究报道了一株TCIPP高效降解菌Ochrobactrum sp. DT-6,能够为环境中TCIPP污染的生物修复提供新的种质...