Wnt信号通路关键基因β-catenin在RA诱导的P19胚胎性癌细胞神经分化过程中的亚细胞分布

Wnt信号参与了小鼠早期神经发育.我们以往的实验结果表明,Wnt信号可引起P19胚胎性癌细胞的神经分化.为了进一步了解Wnt信号在P19神经分化过程中行使功能的时间,我们以Wnt信号通路关键成员β-catenin是否定位在细胞核中作为考察Wnt信号是否能传递到细胞核内调控下游基因活性的指标,分析了Wnt信号在P19细胞神经分化过程中的活性.我们观察到,β-catenin在RA诱导的P19细胞分化的第2到第4天存在核定位.在此期间,Wnt下游基因En-2的表达量也有明显增加.因此,在P19神经分化过程中,Wnt活性可能发生在这一阶段.同时,在神经突的形成、伸长及神经纤维集束过程中,β-catenin在神经突起及神经纤维上也存在特异性分布,提示在此过程中β-catenin可能也行使了功能.     

肌动蛋白与纽蛋白在神经干细胞定向分化为神经元过程中的表达

目的研究新生大鼠大脑皮层神经干细胞定向分化为神经元过程中肌动蛋白(actin)的时空表达变化及其与纽蛋白(vinculin)的关系.方法采用神经干细胞培养、免疫细胞化学技术对神经干细胞定向分化为神经元的过程中actin的时空表达进行研究;采用免疫荧光双标术及共聚焦激光扫描显微术对定向分化神经元过程中,actin与vinculin关系进行探讨.结果在神经干细胞向神经元定向分化过程中, actin在胞体与突起中有表达,且与日渐增,核周表达逐渐增强,分化成熟时胞体与突起中可见丝状细胞骨架随着突起伸展而延伸.免疫荧光双标actin、vinculin在CLSM下观察,分化早期,胞体和突起内均有分布,actin明显强于vinculin,而vinculin于核周及一侧突起较强.分化近成熟期,vinculin反应增强,随着细胞突起生长,在突起中两蛋白共存处可见节段状分布的黄色融合光,直达突起的末端.结论本研究揭示在大脑皮层神经干细胞定向分化为神经元过程中,actin表达变化与神经元发育成熟呈正相关,且actin与vinculin共存.     

大鼠皮层神经干细胞分化为胆碱能神经元过程中骨架蛋白的表达

目的对皮层神经干细胞向胆碱能神经元定向分化及骨架蛋白(β-tubulin)进行探讨研究.方法采用细胞培养技术、免疫细胞化学方法观察皮层神经干细胞向胆碱能神经元定向分化及其过程中骨架蛋白表达变化.结果皮层神经干细胞在去除丝裂原后开始进行分化,至第7d可分化为成熟神经元,NSE、Ach E反应明显阳性,随着分化神经元的逐渐成熟,β-tublin在细胞内的分布亦发生变化,由核周集中分布变化为广泛分布于细胞质内,形成细网状,构成细胞骨架.结论皮层神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的过程中伴随有骨架蛋白的时空变化,随神经元的成熟而构成细胞骨架.     

心肌分化过程中经典Wnt信号促进Isl1表达北大核心CSCD

ISL1是第二生心区的分子标志,在心血管发育中发挥重要作用.在心脏发育过程中,Isl1的表达具有鲜明的时空特异性.本研究利用P19CL6畸胎瘤干细胞作为心肌分化模型,探讨了Isl1在心肌诱导分化过程中的时间特异性表达及经典Wnt信号通路对其的调控.研究发现,Isl1在心肌分化早期高表达,于诱导第4 d到达高峰,随后快速下调.其表达趋势与经典Wnt通路的激活模式具有时间上的同步性.通过加入Wnt3a蛋白及Li Cl激活经典Wnt通路,能够促进Isl1基因的表达,而Wnt通路抑制分子Frizzled-4/Fc和DKK1能够下调Isl1表达.β-catenin过表达及RNAi实验也获得相似的结果.染色质免疫共沉淀实验证实,Wnt通路效应分子LEF1,在细胞分化第4 d与其在Isl1基因启动子上游-2 300 bp处的结合增强,因而促进了Isl1基因的表达.本研究表明,经典Wnt信号能够通过LEF1/β-catenin与Isl1启动子特异结合,调控Isl1基因在心肌早期分化阶段的表达.     

敲除Pofut1不影响胚胎干细胞向神经元分化

蛋白O-连接岩藻糖基转移酶1 (Pofut1)基因缺失可导致Notch分子无法与配体结合并启动信号传递. 为研究Pofut1基因对哺乳动物胚胎干细胞（ESC）向神经分化的影响,利用Pofut1基因敲除的胚胎干细胞与野生型胚胎干细胞,经体外培养诱导拟胚体（EB）分化为神经细胞,计数分化为神经细胞的比例,采用细胞免疫组化染色和real-time PCR等方法,分析神经细胞特异性标志分子的表达. 结果显示,Pofut1基因缺失后,对EBC生长没有明显影响,分化过程中形成的拟胚体数量明显增多,分化的神经样细胞以及神经标志物分子的表达也明显多于对照组;Notch信号缺失对小鼠胚胎干细胞生长无明显影响,但可以促进ES细胞向神经细胞分化.     

纽蛋白在神经干细胞定向分化为神经元过程中的表达及其与辅肌动蛋白的关系

目的探讨纽蛋白(vinculin)在新生大鼠大脑皮层神经干细胞定向分化神经元过程中的表达变化及其与辅肌动蛋白(α-actinin)的关系.方法将神经干细胞分离、培养、分化及鉴定后,采用免疫组化技术对新生大鼠皮层神经干细胞向神经元定向分化过程中,纽蛋白的时空表达进行研究,并采用免疫荧光双标技术及共聚焦激光扫描显微术对神经元定向分化过程中,纽蛋白与辅肌动蛋白关系进行探讨,利用图像分析技术对不同时段分化的神经元中vinculin平均积分光密度进行定量测定.结果在神经干细胞定向分化为神经元的过程中,vinculin由核周淡染分布逐渐至在胞体与突起中密集均匀分布,随着突起伸展而不断地延伸.图像分析结果表示,随神经元的分化成熟,vinculin的表达量呈逐渐增加趋势.在共聚焦激光扫描显微镜下观察免疫荧光双标vinculin/α-actinin在分化早期胞体和突起内均有分布,可见核周和突起两者融合两蛋白共存.近成熟期,随突起生长,两蛋白渐伸入突起,直至末端共存.结论本研究揭示大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中,vinculin表达变化与神经元发育成熟呈正相关,并且vinculin与α-actinin共存.     

心肌分化过程中经典Wnt信号促进Isl1表达

ISL1是第二生心区的分子标志,在心血管发育中发挥重要作用.在心脏发育过程中,Isl1的表达具有鲜明的时空特异性.本研究利用P19CL6畸胎瘤干细胞作为心肌分化模型,探讨了Isl1在心肌诱导分化过程中的时间特异性表达及经典Wnt信号通路对其的调控.研究发现,Isl1在心肌分化早期高表达,于诱导第4 d到达高峰,随后快速下调.其表达趋势与经典Wnt通路的激活模式具有时间上的同步性.通过加入Wnt3a蛋白及Li Cl激活经典Wnt通路,能够促进Isl1基因的表达,而Wnt通路抑制分子Frizzled-4/Fc和DKK1能够下调Isl1表达.β-catenin过表达及RNAi实验也获得相似的结果.染色质免疫共沉淀实验证实,Wnt通路效应分子LEF1,在细胞分化第4 d与其在Isl1基因启动子上游-2 300 bp处的结合增强,因而促进了Isl1基因的表达.本研究表明,经典Wnt信号能够通过LEF1/β-catenin与Isl1启动子特异结合,调控Isl1基因在心肌早期分化阶段的表达.     

脑缺血损伤后BMSCs移植及GAP-43表达在脑神经修复中的作用

目的:探讨大鼠脑缺血/再灌注损伤后骨髓间基质干细胞颅内移植及生长相关蛋白-43(GAP-43)表达在中枢神经再生中的作用机制.方法:成年健康雄性Wistar大鼠260只,随机分为对照组、假手术组各6只,再灌注组48只.再灌注组采用线栓法制备大鼠脑缺血/再灌注模型,根据缺血/再灌注时间细分为再灌注3h、8h、16h、24h、3d、7d、19d和21d 8个时间点各6只.缺血时间均为1h;细胞移植随机分为对照组和移植组各36只,移植时间细分为16h、24h、3d、7d、19d和21d 6个时间点各6只:跑台运动训练随机分为模型组和运动组各24只,训练时间细分为3d、7d、19d和21d4个时间点各6只;水迷宫试验随机分为对照组、再灌注组和康复组各24只,训练时间细分为3d、7d、19d和21d 4个时间点各6只.另4只大鼠作为细胞移植的供体.采用免疫组织化学方法检测TUNEL和GAP-43在皮层区、海马齿状回阳性细胞中的表达,用TTC法观察皮层及海马梗死灶的改变.按照Bederson评分标准进行神经行为检测及功能评分.结果:缺血/再灌注3h点TUNEL阳性细胞增加,24h点达高峰,21d时仍维持较高水平表达;GAP-43阳性细胞缺血/再灌注3h点在两区表达增加,19d点达高峰;21d时降至最低.梗死灶于再灌注8～16h点开始逐渐形成,3d点梗死面体积最大,随后梗死面积逐渐缩小,21d时恢复趋于正常.再灌注组缺血8h～16h点行为症状加重,24h～19d点症状逐渐改善,21d时症状恢复到正常水平.结论:脑缺血后骨髓间充质干细胞移植激发GAP-43特异性表达有效地促进了中枢神经再生,并介导了神经功能的恢复.     

靶向大鼠β-catenin基因的shRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的构建靶向β-连环蛋白（β-catenin）基因的shRNA的真核表达质粒,并筛选出沉默β-catenin基因效果最明显的shRNA表达质粒。方法设计3对针对β-catenin基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA片段的真核表达质粒（shRNA1—3）并行测序分析,电穿孔转染神经干细胞（neural stem cells NSCs）,测定转染率,并分别采用RT—PCR及Western印迹检测β-catenin mRNA和蛋白表达情况,免疫组化方法检测shRNA对神经干细胞分化的影响。结果构建靶向β-catenin基因的shRNA真核表达重组质粒shRNA1,2,3。经筛选,NSCs转染shRNA3后,B—catenin RNA水平和蛋白水平均明显低于阴性对照组和空白对照组（0．08±0．00 vs 0．75±0．01,0．74±0．02;0．12±0．10,vs 0．56±0．02,0．65±0．01,P均〈0．01;与空白组和阴性对照组相比,shRNA3组NSCs分化为GFAP阳性细胞的百分率明显增加,分化为NSE阳性细胞的百分率明显减少（P〈0．05）。结论β—catenin RNA3对神经干细胞的β—catenin表达具有明显抑制作用,可影响细胞的分化。为研究wnt／β-catenin信号途径在NSCs生长分化中的作用奠定基础。     

大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中Tau蛋白表达的研究

目的探讨Tau蛋白在新生大鼠大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中的表达及意义.方法采用细胞培养、免疫细胞化学方法(SABC法)观察及计算机图像分析技术测定Tau蛋白在神经干细胞定向分化为神经元过程中不同时段的表达情况.结果在神经干细胞定向分化为神经元的过程中,Tau蛋白由核周淡染分布渐至在胞体与突起中密集均匀分布,随着突起伸展而不断地延伸,并且Tau蛋白的表达量逐渐增加.结论新生大鼠大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中,Tau蛋白的时空表达与神经干细胞定向分化的神经元形态变化有一定的相关性并在此过程中发挥着重要的作用.