肌动蛋白与纽蛋白在神经干细胞定向分化为神经元过程中的表达

目的研究新生大鼠大脑皮层神经干细胞定向分化为神经元过程中肌动蛋白(actin)的时空表达变化及其与纽蛋白(vinculin)的关系.方法采用神经干细胞培养、免疫细胞化学技术对神经干细胞定向分化为神经元的过程中actin的时空表达进行研究;采用免疫荧光双标术及共聚焦激光扫描显微术对定向分化神经元过程中,actin与vinculin关系进行探讨.结果在神经干细胞向神经元定向分化过程中, actin在胞体与突起中有表达,且与日渐增,核周表达逐渐增强,分化成熟时胞体与突起中可见丝状细胞骨架随着突起伸展而延伸.免疫荧光双标actin、vinculin在CLSM下观察,分化早期,胞体和突起内均有分布,actin明显强于vinculin,而vinculin于核周及一侧突起较强.分化近成熟期,vinculin反应增强,随着细胞突起生长,在突起中两蛋白共存处可见节段状分布的黄色融合光,直达突起的末端.结论本研究揭示在大脑皮层神经干细胞定向分化为神经元过程中,actin表达变化与神经元发育成熟呈正相关,且actin与vinculin共存.     

大脑皮层神经干细胞定向分化为神经元过程中细胞骨架-α辅肌蛋白表达的研究

目的探讨α辅肌蛋白在新生大鼠大脑皮层神经干细胞定向分化神经元过程中的表达变化.方法采用细胞培养、免疫细胞化学方法(SABC法)、免疫电镜技术观察α辅肌蛋白在神经干细胞定向分化神经元过程中不同时段的表达变化.利用图像分析技术对不同时段分化的神经元中α辅肌蛋白平均积分光密度进行定量测定.结果在神经干细胞定向分化神经元过程中,α辅肌蛋白由核周淡染分布逐渐至在胞体与突起中密集均匀分布,随着突起伸展而不断地延伸.免疫电镜可见α辅肌蛋白呈高电子密度球形颗粒.图像分析结果表示,随神经元的分化成熟,α辅肌蛋白的表达量呈逐渐增加趋势.结论大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中,α辅肌蛋白表达变化与神经干细胞定向分化的神经元形态变化相关.     

大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中Tau蛋白表达的研究

目的探讨Tau蛋白在新生大鼠大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中的表达及意义.方法采用细胞培养、免疫细胞化学方法(SABC法)观察及计算机图像分析技术测定Tau蛋白在神经干细胞定向分化为神经元过程中不同时段的表达情况.结果在神经干细胞定向分化为神经元的过程中,Tau蛋白由核周淡染分布渐至在胞体与突起中密集均匀分布,随着突起伸展而不断地延伸,并且Tau蛋白的表达量逐渐增加.结论新生大鼠大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中,Tau蛋白的时空表达与神经干细胞定向分化的神经元形态变化有一定的相关性并在此过程中发挥着重要的作用.     

神经干细胞分化过程中微管蛋白表达变化的光电镜观察

目的对神经干细胞向神经元定向分化过程中微管蛋白的表达变化进行光、电镜观察研究。方法采用细胞培养技术、免疫荧光技术以及免疫电镜技术对神经干细胞向神经元定向分化过程中微管蛋白的表达变化进行观察。结果在神经干细胞向神经元定向分化的不同时期,存在微管蛋白的表达变化,在分化初期以核周附近分布明显,随神经元的成熟散在分布于胞质中及突起内,形成细网状,构成细胞骨架,维持细胞形态。结论在神经干细胞向神经元定向分化过程中伴随有微管蛋白的表达变化,随神经元的成熟而构成细胞骨架,维持细胞形态。     

大脑皮层神经干细胞定向分化为神经元过程中钙调蛋白的表达

目的研究大脑皮层神经干细胞定向分化为神经元过程中钙调蛋白的表达及意义.方法采用细胞培养、免疫细胞化学方法(SABC法)观察钙调蛋白在神经干细胞定向分化过程中不同时段的表达情况.采用计算机图像分析技术对不同时段分化神经元中钙调蛋白的平均积分光密度进行定量测定.结果在神经干细胞定向分化为神经元的过程中,钙调蛋白于细胞核及核周呈阳性表达,随分化神经元的生长细胞核阳性表达逐渐减弱而胞浆增强,同时可见阳性反应物伸入树突及轴突.结论新生大鼠大脑皮层神经干细胞定向分化为神经元过程中,钙调蛋白的表达对神经干细胞定向分化的神经元的生长和发育起着重要作用.     

神经干细胞定向分化过程中溶酶体表达变化的研究

目的对神经干细胞向神经元定向分化过程中溶酶体的表达变化进行观察研究。方法采用细胞培养技术、荧光免疫细胞化学技术以及光电镜酶细胞化学技术对神经干细胞向神经元定向分化过程中溶酶体的表达变化进行观察。结果在神经干细胞向神经元定向分化的过程中,随着细胞分化的不断成熟,溶酶体的表达亦发生着变化。分化初期主要以核周附近表达明显,至神经元分化成熟则散在分布于胞质中及突起内,且表现有圆形、线状两种形态。结论在神经干细胞向神经元定向分化过程中溶酶体发生表达分布的变化,说明其参与了细胞的代谢和细胞内物质的运输。     

未分化和分化足细胞生物学性状及相关结构蛋白表达的变化

体外33℃许可条件下培乔由H-2Kb-tsA58转基因小鼠所建立的禾分化足细肥系,开在37℃非许可条件下诱导其分化.观察足细胞分化后形态学改变;MTT法测定细胞的生长曲线;红色荧光染料PKH-26标记足细胞,追踪其在子代细胞中的分布,检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期的改变;Western印迹检测足细胞相关蛋白CD2AP、α-actinin和足细胞分化相关蛋白nephrin的表达;免疫荧光结合激光共聚焦方法检测CD2AP、nephrin,α-actinin、F-肌动蛋白和微管蛋白的表达变化.结果显示:与未分化足细胞相比,分化足细胞形态发生改变,生长速度减慢,增殖能力下降:细胞周期表现为G0/G1期细胞比例的增多和S期及G2/M期的细胞比例下降;CD2AP、neDhrin和α-actinin的表达明显增高;CD2AP、nephrin、α-actinin、F-肌动蛋白和微管蛋白在表达分布上均发生明显的改变.以上结果表明,足细胞分化后生物学性状明显发生改变,细胞骨架重新分布:CD2AP、nephrin、α-actinin、F-肌动蛋白和微管蛋白均在足细胞的分化过程中发挥重要作用.     

原代培养脊髓神经元线状溶酶体与细胞骨架蛋白-纽蛋白关系的研究

目的研究原代培养脊髓神经元线状溶酶体(nematolysosome)的形成与分布及其与细胞骨架蛋白-纽蛋白(vinculin)的关系.方法用细胞松弛素D(cytochalasin D,CD)及佛波醇酯(phorbol myristate acetate,PMA)处理原代培养脊髓神经元,用免疫荧光双标记纽蛋白及组织蛋白酶D(cathepsin D)、酸性磷酸酶(ACPase)、电镜细胞化学及共焦激光扫描显微镜方法研究线状溶酶体与纽蛋白的关系.结果在正常对照组神经元,组织蛋白酶D(标记溶酶体)与纽蛋白分布于胞质及突起内;在CD及PMA处理神经元,纽蛋白及组织蛋白酶D的分布呈向心性移动,但集聚的部位不同;电镜酶细胞化学方法显示CD组及PMA组神经元内线状溶酶体均增多.结论组织蛋白酶D及纽蛋白在培养脊髓神经元内协同分布,CD及PMA均可引起二者分布的变化,提示纽蛋白可通过增强细胞内吞体/溶酶体系统活动而使线状溶酶体增加,也可通过促进丝状肌动蛋白聚合而影响线状溶酶体的形成及运动.     

纽蛋白在原代培养脊髓神经元的分布及其与神经元形态的相关性

目的　用免疫组织化学及形态学等方法对原代培养大鼠脊髓神经元的形态及其纽蛋白 (vinculin)分布进行研究。方法　实验采用原代培养的大鼠脊髓神经元 ,用细胞松弛素 D(cytochalasin D) -丝状肌动蛋白解聚剂处理细胞后 ,用相差显微镜观察细胞形态 ,同时用单克隆抗体免疫组化方法显示细胞内纽蛋白的分布。结果　原代培养的脊髓神经元可见 2～4个细长的突起 ;免疫组织化学方法显示纽蛋白在神经元的胞体及突起均有分布。细胞松弛素 D处理细胞后 ,神经元胞体变大 ,轮廊不清 ,突起增多 ,变短、变粗 ,多分支且分支末端膨大 ;免疫组织化学方法显示纽蛋白在核周的分布明显增加 ,而在突起内的分布则变得不连续 ,呈散在点状。结论　丝状肌动蛋白 (filem ental- actin,F- actin)的完整性对维持神经元的正常形态是必需的 ;神经元形态的变化与纽蛋白分布的变化相关     

纽蛋白在原代培养脊髓神经元的分布及其在神经元形态的相关性

目的：用免疫组织化学及形态学等方法对原代培养大鼠脊神经元的形态及其纽蛋白（vinculin)分布进行研究。方法：实验采用原代培养的大鼠脊髓神经元,用细胞松驰素D（cytochalasinD)－丝状肌动蛋白解剖处理细胞后,用相差显微镜观察细胞形态,同时用单克隆抗体免疫组化方法显示细胞内纽蛋白的分布,结果：原代培养的脊髓神经元可见2－4个细长的突起,免疫组织化学方法显示纽蛋白姑神经元的胞体及突起均有分布,细胞松驰素D处理细胞后,神经元胞体变大,轮廓不清,突起增多,变矩,变粗,多分支且分支末端膨大,免疫组织化学方法显示纽蛋白在核周的人布明显增加,而且在突起内的分布则变得不连续,呈散在点状。结论：丝状肌动蛋白（filemental-actin,F-actin）的完整性对维持神经元的正常形态是必需的,神经元形态的变化与纽蛋白分布的变化相关。     

胎胰源性Nestin阳性细胞向多巴胺能细胞元定向诱导分化的研究

目的：探讨胎儿胰岛源性Nestin（神经上皮干细胞蛋白）阳性干细胞分化为多巴胺能神经元的潜能。方法：用胶原酶消化法分离胎儿胰岛,贴壁培养后获得增殖力旺盛的细胞;用免疫组化法、免疫荧光法分别检测其增殖细胞核抗原（PCNA）及神经干细胞标志物Nestin的表达;用流式细胞术测定Nestin阳性细胞的比例;经N2培养液筛选后,分别用SHH（sonichedgehog）蛋白、成纤维细胞生长因子（FGF）8、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和脑源性神经营养因子（BDNF）向多巴胺能神经元定向诱导,检测诱导细胞的多巴胺能神经元标志酪氨酸羟化酶（TH）和芳香左旋氨基酸脱羧酶（AADC）的表达情况。结果：免疫荧光显示,从胎儿胰岛分离的干细胞表达PCNA和Nestin;流式细胞术检测Nestin阳性率达13．74％;筛选后向神经细胞定向诱导分化,细胞表达TH和AADC。结论：从胎儿胰岛中可以分离出Nestin阳性的神经干细胞,该细胞具有向多巴胺能神经元定向分化的能力。     

丹参诱导鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞优化方案及电生理研究

分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs), 采用丹参对4～5代MSCs进行反复多次诱导分化及再分化, 将其诱导分化为神经样细胞, 倒置显微镜下连续观察形态学变化, 通过免疫荧光细胞化学检测神经样细胞巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白 (neurofiliament, NF)、突触(小)泡蛋白(synaptophysin) 的表达, 采用细胞膜电位特异的荧光探针DiBAC4(3)标记细胞, 激光扫描共聚焦显微镜动态监测细胞受高钾刺激前后的荧光强度变化, 观察细胞电生理反应.结果显示: MSCs第1次经过丹参诱导2 h后, MSCs伸出突起, 向神经性细胞形态转变, 此时巢蛋白表达率为 (95.1±2.1)% (x±s, n=3), 基本不表达NF; 随着诱导分化及去分化过程的次数增加, 细胞分化为神经样细胞的时间缩短, 突起拉长并交互缠绕呈复杂网状, MSCs第4次经过丹参诱导1 h后, NF表达率(95.3±1.6)% (x±s, n=3), 并表达突触(小)泡蛋白, 5 h后突触(小)泡蛋白表达更为广泛; 激光共聚焦扫描显微镜显示第4次诱导5 h后的细胞在高钾刺激下发生去极化, 胞内荧光强度瞬时增强, 而MSCs空白对照对高钾刺激无反应.本优化诱导方案可以高效率地诱导MSCs分化为具有电生理特性的神经样细胞.     

大鼠皮层神经干细胞分化为胆碱能神经元过程中骨架蛋白的表达

目的对皮层神经干细胞向胆碱能神经元定向分化及骨架蛋白(β-tubulin)进行探讨研究.方法采用细胞培养技术、免疫细胞化学方法观察皮层神经干细胞向胆碱能神经元定向分化及其过程中骨架蛋白表达变化.结果皮层神经干细胞在去除丝裂原后开始进行分化,至第7d可分化为成熟神经元,NSE、Ach E反应明显阳性,随着分化神经元的逐渐成熟,β-tublin在细胞内的分布亦发生变化,由核周集中分布变化为广泛分布于细胞质内,形成细网状,构成细胞骨架.结论皮层神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的过程中伴随有骨架蛋白的时空变化,随神经元的成熟而构成细胞骨架.     

丹酚酸B促进胎鼠大脑皮质神经干细胞增殖、突起生长和分化

丹参是一种常用于治疗脑卒中的传统中草药,丹酚酸B是其有效成份之一.但人们对丹酚酸B如何影响神经干细胞的生长还了解甚少.本研究用MTT、流式细胞术、免疫荧光和RT-PCR技术检测丹酚酸B对胎鼠大脑皮质神经干细胞增殖、突起生长和分化的作用.结果显示,20和40μg/mL丹酚酸B对促进神经干细胞增殖的作用相似,适量的丹酚酸B可促进神经干细胞增殖并形成较多的神经干细胞球,其促增殖作用通过提高G2/S期细胞的数量而实现.丹酚酸B还可促进神经干细胞球发出较多的突起并分化出较多的成熟神经元.分化开始时,tau,GFAP和nestin mRNA均有表达.但分化后的细胞与对照组比较,tau mRNA表达增多,而GFAP mRNA表达减少.说明外源性的丹酚酸B具有促进神经干细胞增殖并向神经元分化的作用,有望成为一种获取更多神经干细胞和促进神经干细胞分化的药物.     

脊髓源神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元过程中Aldoc和Stmn1表达的研究

目的探讨脊髓源神经干细胞在诱导分化为胆碱能神经元过程中Aldoc和Stmn1的表达变化情况。方法从孕17天Wistar胚胎大鼠取出脊髓组织,制成细胞悬液,采用含EGF和bFGF的无血清限定性培养基培养,然后进行诱导分化,观察脊髓源神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况,应用荧光定量PCR方法分析Aldoc和Stmn1基因在脊髓源神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元的过程中的表达变化情况。结果神经干细胞在诱导分化为胆碱能神经元后,经免疫荧光检测有ChAT阳性细胞表达;Aldoc基因的表达量在胆碱能神经元较神经干细胞低(P<0.05);Stmn1基因的表达量则在诱导分化后较神经干细胞升高(P<0.05)。结论 Aldoc对神经干细胞的干性维持有重要作用,Stmn1在胆碱能神经元的成熟过程中起作用。     

大鼠脊髓匀浆上清诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:观察大鼠脊髓匀浆上清诱导骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)形成的神经元样细胞形态特征.方法:通过贴壁法培养分离大鼠骨髓MSCs,体外扩增纯化后加入正常大鼠脊髓匀浆上清诱导72h,倒置显微镜下观察诱导前后细胞的形态结构.激光共聚焦显微镜观测钙离子细胞形态和荧光强度变化,免疫细胞化学方法鉴定诱导后细胞的表型特征.结果:倒置显微镜下可见MSCs呈纺锤形和多角形,核居中,有1-2个核仁,诱导后细胞呈神经元样,细胞伸出较长的轴突样和树突样突起.免疫细胞化学法显示NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NF(神经丝蛋白)阳性,GFAP(神经胶质细胞酸性蛋白)阴性.共聚焦显微镜扫描脊髓匀浆上清诱导前细胞形态呈细长的梭形,细胞核不明显,胞体染色强,突起染色弱,荧光像素值低;诱导后,细胞呈现神经元样形态,胞体大,有多个突起,胞体及各突起染色强,荧光像素值高.结论:大鼠脊髓匀浆上清液可在体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞.     

Sema4C在神经干细胞中的表达

目的：探讨Sema4C及其相关蛋白在神经干细胞中的表达。方法：利用RT-PCR、WestemI,blot、免疫荧光等方法对神经干细胞中内源性Sema4C及其相关蛋白的表达进行检测。结果：Sema4C及其相关蛋白在神经干细胞中表达,并且Sema4C在神经干细胞终末分化细胞神经元中表达,但在星形胶质中不表达。结论：Sema4C及其相关蛋白在神经干细胞中表达,提示Sema4C及其相关蛋白可能在神经干细胞中起作用。     

RCMV感染星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响

探讨大鼠巨细胞病毒（rat cytomegalovirus,RCMV）感染大鼠星形胶质细胞后,对神经干细胞分化的影响。原代分离培养新生大鼠星形胶质细胞和胚胎海马神经干细胞,将星形胶质细胞感染RCMV后和神经干细胞在Transwell24孔共培养体系下进行共培养,同时设对照组;用免疫荧光染色等方法检测神经干细胞与感染RCMV的星形胶质细胞共培养后,其分化细胞中神经元微管相关蛋白（microtubule-associated protein 2,MAP2）和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（glial fibril—lary acidic protein,GFAP）的表达。结果发现,感染RCMV的星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞分化减慢,分化成的神经元和星形胶质细胞比率低于对照组,提示星形胶质细胞感染RCMV后可抑制神经干细胞的分化,可能与RCMV影响星形胶质细胞合成和分泌各种营养因子,干扰了神经干细胞的分化进程有关。     

人胚胎干细胞分化为神经干细胞诱导方法的对比研究

目的探讨人胚胎干细胞分化为神经干细胞过程中,经拟胚体（embryonic body,EB）法和直接分化法的不同效率。方法人胚胎干细胞常规培养消化后,分为两组：A组,经EB法分化;B组,添加noggin和ITSFn直接分化法。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞各阶段标志物,免疫荧光及流式细胞仪观察两组细胞Nestin阳性细胞率。神经干细胞继续分化,免疫荧光、RT-PCR法检测MAP2、GFAP表达。结果RT-PCR检测到OCT4、nestin表达。B组nestin阳性细胞率明显高于A组,差异有统计学意义（P〈0.01）,且诱导周期短于A组。神经干细胞继续分化,得到不同数量的神经元和胶质细胞,MAP2、GFAP分别阳性。结论在体外采用定向分化诱导,人胚胎干细胞不经EB,可直接定向分化为神经干细胞,且诱导效率比EB法高。因此直接分化法是一种经济实用的诱导方法。     

川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

为了探讨川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞的作用,以小鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,实验分为空白对照组、β-巯基乙醇（BME）阳性对照组和川芎嗪诱导组。采用荧光免疫化学和Western blot方法,分别检测神经干细胞巢蛋白（nestin）和经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达;RT-PCR检测诱导不同时间对神经细胞相关基因Nestin、NSE、β-微管蛋白III（β-Tubulin III）和核受体相关因子-1（Nurr1）mRNA表达的影响。结果显示川芎嗪诱导间充质干细胞24 h后,细胞形态发生显著改变,细胞突起形成且数目不等,形成神经元样细胞。细胞死亡率低于β-巯基乙醇诱导组。免疫荧光化学法和western blot结果显示：川芎嗪诱导后的细胞nes-tin和NSE蛋白表达呈阳性,且表达丰度显著高于β-巯基乙醇诱导组。川芎嗪作用不同时间的BMSCs表达神经细胞相关基因Nestin、β-Tubulin III、NSE和Nurrl。结果表明川芎嗪能定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,是较理想的诱导剂。