用固定了DNA探针的传感器定量乙型肝炎患者HBV获得成功

东芝环境技术研究所小组使用在金电极上固定了DNA探针的基因传感器,定量测定乙型肝炎患者血清中的乙型肝炎病毒(HBV)量获得成功。首次证明用该公司开发的基因传感器能检测实际的临床样品。有待解决的课题是提高灵敏度、降低成本等。但是基因传感器与利用基因扩增反应法的高灵敏度检测法相比,可缩短检测时间而且价格低廉。所以,如果能实用化,就有可能在基因水平的诊断上发挥威力。在1995年     

9月在欧美销售诊断衣原体属用PCR药盒

瑞士Hoffmann-La Roche 公司从9月开始在欧洲、美国销售使用聚合酶链反应法(PCR 法)的检查衣原体属用的DNA 探针诊断药盒。使用PCR 法的DNA 诊断药盒的开发为世界首创。DNA 诊断药已到新阶段。估计在日本93年下半年以后销售。DNA 探针诊断药包括在日本销售的东雷、中外制药公司等的产品;即使不扩增也能检测出基因本身     

基于重组荧光病毒的流式细胞术检测抗CV-A16中和抗体的研究

建立基于重组荧光病毒CV-A16-EGFP的流式快速测定CV-A16感染或免疫动物血清中和抗体效价的方法。在Vero细胞上对不同感染时间点,不同病毒接种量情况下的CV-A16-EGFP病毒的增殖特性进行分析;随后,利用流式检测不同病毒滴度下的EGFP阳性细胞数量、EGFP阳性细胞百分比(%)、及EGFP阳性细胞的平均荧光密度值,并换算出不同病毒滴度与三者之间分别的数值对应关系。最后,以平均荧光密度值作为替代判断病毒病变效应的指标,并利用流式荧光检测及传统微量中和方法对CV-A16感染恒河猴血清及CV-A16免疫的羊血清中和抗体效价进行检测,并对两种方法的检测结果进行比较。在感染后24h,不同的病毒滴度与对应的平均荧光密度值呈良好的线性关系。利用流式荧光检测的CV-A16中和抗体效价与传统的微量中和实验相比,两者检测结果具有较好的线性相关性,线性回归系数为R~2=0.8026;传统的微量中和实验检测的平均中和抗体效价略高于流式荧光检测的中和抗体效价,但是差异无统计学意义(P0.05)。利用流式荧光检测可以迅速检测CV-A16中和抗体效价,并且实验结果与传统的微量中和实验具有较好的一致性。相比与传统方法,该方法更简单、快速、灵敏,为CV-A16抗血清的中和抗体检测提供参考。     

用序列比对设计的茎环结构探针检测金黄色葡萄球菌

基于金黄色葡萄球菌16S rRNA基因序列,采用序列比对设计了一种茎环结构的寡聚核苷酸探针。探针的环序列即为金黄色葡萄球菌16S rRNA基因序列的其中一个片段,同其他菌种的16S rRNA基因序列误配2个以上的核苷酸,因此能高度专一、灵敏的检测金黄色葡萄球菌16S rRNA。根据分子信标技术和酶联免疫分析的原理,评估一个实验方法,即利用能构象转换的、固定化的茎环结构探针酶联检测靶核酸。由于探针的特异性加强,这个检测系统能有效的排除假阳性即不会出现误配一个核苷酸的情况。采用微量浓度测定分析,最低下限可检测出大约4ng的金葡球菌16SrRNA。这种方法的灵敏度比其他常规检测方法高出了至少一个数量级。     

日本宝酒造委托以色列Orgenics公司研制用于检测混入医药品中的核酸的 DNA探针

日本宝酒造(宝酿酒公司)委托以色列的 Orgenics 公司研制检测混入医药品中的 DNA的 DNA 探针。这种探针将用于检验药盒,以检测由基因重组所制造的医药品中是否混入了DNA。美国有规定,对由基因重组所制造的医药品须标明其中不含有多余的成分,他们利用DNA 探针检测混入的 DNA。但是,日本现在还没有这种规定,也还没有用干检测的制品。今后日本也将扩大研制基因重组的医药品,也将需要有检测 DNA 的检查。     

克隆同源性高的基因的技术

参加神奈川科学技术研究所(KAST)项目的顺天堂大学医学部第2病理学助手鹤井博理等与KAST第五研究室主任加藤诚志合作开发了高效克隆基因的方法,即使用固相化DNA探针,搜集同源性高的cDNA,并高效地克隆了其基因。利用这种方法,大幅度提高了从克隆的动物基因的碱基序列中克隆人基因时和钓出家族基因的工作效率。这项成果在福冈市召开的日本分子生物学会上发表。鹤井等首先使用固相化DNA探针开发从液相分离核酸片段,以此为酶,使其双链化,整合到载体上     

人乳头瘤病毒16型E7密码子优化后的原核表达及免疫原性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因密码子优化后的原核表达系统,通过特异性抗体制备评价E7融合蛋白的免疫原性。方法人工合成优化后的HPV16 E7基因,利用特异引物扩增HPV16 E7基因。将E7基因连接至原核表达载体构建重组表达质粒pMAl-c2X-E7,转化至感受态细胞DE3后,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达产物E7融合蛋白。纯化后的E7融合蛋白免疫动物,采用ELISA检测动物血清效价。结果 E7基因PCR产物的测序结果与优化后的目的基因序列比对一致。表达的E7融合蛋白经SDS-PAGE分析表明:在相对分子质量50 000处有特异性表达带,与预期相符。以E7融合蛋白制备的多克隆抗体其血清效价可达1∶64 000。结论成功构建的重组表达质粒pMAl-c2X-E7可有效表达MBP-E7融合蛋白,E7融合蛋白具有良好的免疫原性。     

开发使用DNA探针结合粒子的检体DNA浓缩法

日本合成橡胶公司和日本罗氏公司小组使用结合了DNA探针的胶乳粒子,开发了简便且高灵敏地提取、浓缩检体中的病原菌和病毒DNA的技术。与神奈川县卫生研究所病毒部部长今井光信等合作使用这项技术用AIDS患者的血液进行检测实验。结果表明,比用普通聚合酶链反应法(PCR)的检测灵敏度高数十倍。 PCR反应是用基因扩增法扩增检测对象——基因高效率地检测的方法。但是,PCR反应的试剂量限于数十微升,所以其界限为数十微升。一旦不含检测对象就检测不出来。如果使用日本合成橡胶公司和日本罗氏开发的技术,在PCR前就能浓缩标记DNA(约330倍),据说在1ml血液中有1个分子,使用PCR     

地高辛标记探针用于人白细胞基因定位

用地高辛标记探针在人染色体上进行了基因定位。使用了酶显色和荧光显色,两者得到了相同的定位结果,特异区阳性率分别为11.6％和19.8％’荧光显色特异性较高,说明基因定位效果受显示系统效率的影响,地高辛标记探针用于基因定位有比放射性探针、生物素探针更多的优越性。又讨论了几个影响效果的因素,提出以SDC代替甲酰胺洗涤;紫外照射于杂交前R显带方法能取得较好的基因定位效果。     

开发利用土壤杆菌的无标记植物性状转化法

日本烟草产业（ＪＴ）公司成功地开发了可从性状转化植物高效地去除选择性标记的利用土壤杆菌的无标记性状转化法。不仅限于双子叶植物,也能进行单子叶植物水稻的基因导入。ＪＴ公司在川崎市召开的日本育种学会上发表了该项成果。在植物的性状转化中使用了卡那霉素等基因,但是,如果能排除标记,就能反复使用单一标记,所以希望此法能在需要导入代谢系基因群等多种基因时使用。因此,选择标记的去除法是植物重组育种必需的技术。ＪＴ公司开发的载体是在其１９９４年开发的、土壤杆菌（不仅能向双子叶植物中导入基因而且也能向水稻和玉米等…     

霍乱毒素(CT)基因探针的构建及其对霍乱弧菌的检测

用体外DNA重组技术构建了CT基因重组质粒pMM-CTII。应用XbaI/EcoRl双酶解,琼质糖凝胶制备电泳回收含C2基因的片段,以DNA缺口转译技术用a-32P标记的CT基因探针与01群霍乱弧菌经典型及埃尔托生物型产毒株杂交为阳性,与01群霍乱弧菌非产毒株及非01群无毒株杂交为阴性。对从临床及外环境分离的埃尔托霍乱弧菌进行了检测,流行株52株,检出率为92％;抗性株50株,检出率16％。显示利用CT基因分析较噬菌体分类更确切可靠。     

人巨细胞病毒抗体检测方法的应用研究

目的确定用于筛选人巨细胞病毒(HCMV)IgG阳性血浆的ELISA试剂和用于HCMV免疫球蛋白成品检定的中和试验方法。方法比较目前国内外现有的人巨细胞病毒IgG抗体检测方法(3家ELISA试剂和3种病毒中和试验)的相关性。结果德国赛润和意大利德塞的ELISA试剂与成都蓉生微量中和试验及台湾宝血的蚀斑减少中和试验的相关性很好(r299%)。结论从成本和使用便利性考虑,建议使用意大利德赛的ELISA试剂盒用于原料血浆的筛选,使用成都蓉生的微量中和试验作为成品效价检定的方法。     

FDA局长强调新法规的重要性

美国食品与药物管理局(FDA)食品安全性和应用营养学中心主任Richard J.Ronk于5月16日在东京召开的日本食品卫生学会(纪念学会成立30周年学术讲演会上)指出,对利用基因工程开发的植物为原料的食品也要有新的法规.在美国开发导入植物病毒的编码蛋白基因和杀虫毒素基因的植物,已接近商品化.他主张抓住这种形势,从保护消费的立场必须采取新的立法措施.在题为“90年代的食品卫生对策”的讲演中,Ronk从食品卫生的观点谈及农药的问题时说:“今后限制使用农药,加速探索代替物,同时,在延长毒性比较强的农药注册时,要树立考虑使用农药的农作物安全性的农业利用优良规范的概念”.就基因重组农作物来说,他主张从消除消费者的疑虑的观点希望能引进新的法规.     

用核酸杂交法检查北京地区幼儿园正常儿童尿中人巨细胞病毒DNA

以克隆的人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,简称HCMV)DNA片段做探针,用核酸杂交方法检查了50例北京地区幼儿园正常儿童的尿标本。查出HCMV DMA阳性者24例,占48％。在两个群体和两个年龄组之间,阳性检出率有显著性差异。利用探针可查出同源DNA5～10pg,而不与其它病毒或细胞DNA杂交。标记不同的探针,使用不同的固定方法,其敏感性不同。此法可在分子水平上查出HCMV基因,比分离病毒更迅速敏感。     

地高辛标记Ucp2基因RNA探针的制备和应用

目的:制备用于检测小鼠胚胎早期Ucp2基因表达的地高辛标记的特异性RNA探针。方法:提取小鼠胚胎脑组织总RNA,设计引物,通过RT-PCR方法获取Ucp2基因片段,将其克隆到pGEM-T载体。分别利用Sp6、T7和Ucp2特异性引物,PCR扩增获得转录模板,通过Sp6及T7 RNA聚合酶,获得地高辛标记的正义、反义Ucp2 RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后,通过全胚胎原位杂交分析制备探针的特异性和杂交效果。结果:成功获得Ucp2基因正义、反义探针,反义探针能高效灵敏检测到Ucp2基因在小鼠胚胎Ed9.5、Ed10.5神经系统呈现高表达,而正义探针未能检测到表达信号。结论:成功制备了特异高效的地高辛标记Ucp2 RNA原位杂交探针,为进一步研究Ucp2基因在小鼠胚胎组织中的表达,尤其在神经组织的定位奠定基础。     

开发用多种萤光色素检测基因点突变的方法

德岛大学医学部教授板仓光夫、助手岩花弘之等使用多种萤光色素和计算机图像开发了检测基因点突变的MF(Multiple Fiuoresence-based)-PCR-SSCP法。检测灵敏度高,使用萤光标识能处理多种试剂,所以有可能应用于临床检查。另外板仓等打算以500名痛风患者为对象,使用该MF-PCR-SSCP法,分析被认为是导致痛风之一的人ATase基因的变异。在大阪召开的第67届日本生化学会上发表了其结果。     

用简化的微量方法分析EGF受体基因在培养细胞中的表达

利用放射性同位素标记的基因片段或cDNA探针进行核酸分子杂交是分析基因表达的有效手段。将细胞DNA或RNA样品经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上,然后与放射性探针杂交,即Southern印迹法和Northern印迹法已被普遍采用,为了简化操作,也常使用(Dot Blot)点印迹法。利用上述技术进行基因或基因产物分析时,首先需要从细胞分离、纯化RNA和DNA。如果需     

病原性孤菌

<正>孤菌在海洋细菌中占有相当大的比例。生活在海洋周围、且喜食海产物的日本人,接触孤菌的机会较多。现已知11种人的病原性孤菌(表1)(但是霍乱菌和纳格孤菌在分类学上属同一种类)。非病原性孤菌已知20种以上。在人的病原性孤菌中已知的主要致病因子仅为霍乱菌的霍乱毒素,其它菌种的致病机制尚未明确。其中有仅以“是从患者身上分离出的”为理由,便作为病原性孤菌。因此,这些细菌致病因子的阐明,对于明确致病机制和区别病原性菌株和非病原性菌株都很有益。在基因水平上分析特别重要的致病因子并制造相应的基因探针。目前,这些探针还未用于临床检查中,但已用于致病因子的分析和流行病学的研究中,本文作一综述,并论述今后开发和利用DNA探针的意义。 (一)病原性孤菌的致病因子     

HPV病毒检测分型芯片的研制和优化

研制和优化寡核苷酸芯片以初步实现对多种常见HPV(Human papillomavirus)病毒的分型检测.应用生物学软件对四型常见HPV病毒(6、11、16、18型)的全基因组序列进行分析,设计具有型特异性、熔解温度(Tm)相近的～60 mer寡核苷酸探针,对玻片片基进行优化处理后,点样制备成寡核苷酸基因芯片.将含HPV全长基因序列的质粒作为阳性标准品,利用梯度限制性荧光标记技术对其进行荧光标记,标记好的样品与芯片杂交.结果显示HPV样品与相应的型特异性探针杂交有明显的荧光信号,而与阴性对照探针和空白对照探针没有杂交信号.通过对芯片片基处理和样品荧光标记方法的优化,可以提高芯片检测的杂交特异性和荧光信号强度.     

垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落16S rRNA基因的ARDRA分析

利用特异性的引物对,选择性扩增垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落的18S rRNA基因片断,在此基础上建立16S rDNA克隆文库,经古细菌通用寡核苷酸探针的原位杂交筛选后,克隆文库内古细菌16S rDNA扩增片断的多样性通过ARDRA分析（amplified rDNA restriction analysis)而获得,利用PCR将各组重克隆子内的16S rDNA外源片断再扩增出来后,两种限制性内切酶－Hha I和HaeⅢ－被分别用于16S rDNA克隆片断的限制酶切分析,结果表明,随机选出的70个古细菌16S rDNA克隆片断被妥为21个不同的ARDRA型（组）,其中的两个优势型总共占了所有被分析克隆子的60％,而其余19个型的相对丰度均处于较低的水平,当中的14个型更仅含有1个克隆子,通过对16S rRNA基因的PCR扩增,克隆及其ARDRA分析,能快速地获得有关填埋场渗滤液中古细菌群落的结构及其多样性的初步信息。