HMG蛋白质与人ε—珠蛋白基因5‘旁侧调控元件DNA相 …

ＨＭＧ蛋白质是一类在染色质内含量极为丰富的非组蛋白质,它们在染色质的结构与功能中起着重要的作用。本文运用凝胶电泳阻抑法和ＤＮａｓｅＩ足迹法分析了ＨＭＧ蛋白质与人ε－珠蛋白基因５＇旁侧调控元件ＤＮＡ之间相互作用的情况。结果表明ＨＭＧ蛋白质（１／２）既能与两个正调控元件（－５３５￣－４５３ｂｐ和－４４６￣－４１９ｂｐ）ＤＮＡ相结合,也能与启动子（－１７７￣＋１ｂｐ）ＤＮＡ相结合;而ＨＭＧ蛋白质（１４／     

与人体ε-珠蛋白基因5'旁侧正调控元件(ε-PREI)专一结合的调控因子的初步研究

人体ε－珠蛋白基因５′旁侧ＤＮＡ序列对该基因时空表达与调控起着十分重要的作用。本文运用凝胶电泳阻抑法,ＤＮａｓｅＩ足印法和Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析法发现在胚胎型红白血病细胞株Ｋ５６２细胞中有一个特异的核蛋白因子（简称ε－ＳＳＰ,其分子量大约为８０ｋＤ）,它能专一地与人体ε－珠蛋白基因５′旁侧一个红细胞专一和发育时期特异的正调控元件（ε－ＰＲＥＩＩ,－４４６ｂｐ到－４１９ｂｐ）相结合。竞争实验表明该因子与ε－ＰＲＥＩＩ的结合能被人体ε－珠蛋白基因启动子区ＤＮＡ片段（－１７７ｂｐ到＋１ｂｐ）所竞争;同时也能被人体β－类珠蛋白基因远侧端调控元件ＬＣＲ中的ＤＮａｓｅＩ超敏感点Ｉ核心区ＤＮＡ片段（－１０９６５ｂｐ到－１０６８１ｂｐ）与超敏感点ＩＩ核心区ＤＮＡ片段（－１４９９３ｂｐ到－１４７１８ｂｐ）所竞争。我们的结果提示了ε－ＳＳＰ不仅是一个与红细胞专一性和发育时期特异性相关的反式调控因子,而且它可能介导远侧端调控元件（ＬＣＲ）与近侧端调控元件启动子之间的相互作用,共同调节ε－珠蛋白基因在胚胎期的表达。     

与人体ε—珠蛋白基因5‘旁侧正调控元件（ε—PREⅡ）…

人体ε－珠蛋白基因５’旁侧ＤＮＡ序列对该基因时空表达与调控起着十分重要的作用。本文运用交电泳阻抑法,ＤＮａｓｅＩ足印法和Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析法发现在胚胎裂红白血病细胞株Ｋ５６２细胞中有一个特异的核蛋白因子,它能专一地与人体ε珠蛋白基因５‘旁侧一个红细胞专一和发育时期特异的正调控元件（ε－ＰＲＥⅡ,－４４６ｂｐ到－４１９ｂｐ）相结合竞争实验表明该因子与ε－ＰＲＥⅡ的结合能被人体ε－     

羟基脲促进HFL细胞分化机制的研究

以往研究表明,用羟基脲诱导人红白血病细胞（ＨＥＬｃｅｌｌ）后,能促进成年型β－珠蛋白基因表达,使ＨＥＬ细胞趋向终末分化,本文试图进一步揭示羟基脲诱导ＨＥＬ细胞分化的分子机制,ＧＭＳＡ与Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析结果显示,随着羟基脲诱导ＨＥＬ细胞时间延长,细胞核内的ＧＡＴＡ－１转录因子的含量增加,它与β－珠蛋白基因５旁侧ＤＮＡ序列内一个正调控序列（ＰＣＲ：－２２３～－１９４ｂｐ）以及人工合成的ＧＡＴＡ／     

羟基脲促进HEL细胞分化机制的研究

以往研究表明, 用羟基脲诱导人红白血病细胞（ＨＥＬｃｅｌｌ）后, 能促进成年型β珠蛋白基因表达, 使ＨＥＬ细胞趋向终末分化。本文试图进一步揭示羟基脲诱导ＨＥＬ细胞分化的分子机制。ＧＭＳＡ 与Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹分析结果显示, 随着羟基脲诱导ＨＥＬ 细胞时间延长, 细胞核内的ＧＡＴＡ１ 转录因子的含量增加, 它与β珠蛋白基因５＇旁侧ＤＮＡ 序列内一个正调控序列（ＰＣＲ：－ ２２３～－ １９４ ｂｐ） 以及人工合成的ＧＡＴＡＤＮＡ 序列结合能力增加; 与此相反,细胞核内的ＧＡＴＡ２ 转录因子的含量下降, 它与ＧＡＴＡＤＮＡ 序列结合能力也下降。此外, 还检测到在羟基脲诱导ＨＥＬ细胞后, 核内与ＹＹ１ 类似的一个转录因子含量也迅速下降。实验结果表明ＧＡＴＡ２ 可能在红系细胞早期分化中起重要作用, 而ＧＡＴＡ１ 则在红系细胞终末分化过程中起调控作用。推测类似ＹＹ１ 的一个转录因子可能具有抑制ＨＥＬ细胞趋向终末分化的功能     

乙肝病毒核衣壳启动子内三链DNA的形成

用电泳迁移分析方法研究了２１ｎｔ脱氧寡核苷酸Ｇ３ＴＧ２ＴＧＴ２Ｇ５ＴＧ２ＴＧＴ（ＣＰ１）与１２９ｂｐ的乙肝病毒（ＨＢＶ）核衣壳启动子（Ｃｐ）片段内一位点结合形成的三链ＤＮＡ的特异性及稳定性．在克隆有ＨＢＶ基因组的质粒ｐＣＰ１０的酶切产物中,ＣＰ１仅与含Ｃｐ的１２９ｂｐ片段结合．在２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋溶液中其解离常数（Ｋｄ）为１．４×１０－７ｍｏｌ／Ｌ．不同离子稳定三链ＤＮＡ的效果依次为ｓｐ４＋（精胺）＞Ｍｇ２＋＞Ｚｎ２＋＞Ｎａ＋＞Ｋ＋,离子之间存在相互竞争作用．比ＣＰ１多一误配碱基的脱氧寡核苷酸Ｇ２ＴＧ２ＴＧＴＧ３ＴＧ２ＴＧ２ＴＧ２Ｔ（ＣＰ２）在２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋溶液中与Ｃｐ结合的Ｋｄ值约为ＣＰ１的１／７,而在６０ｍｍｏｌ／ＬＫ＋或５ｍｍｏｌ／ＬＺｎ２＋溶液中检测不到它与Ｃｐ的结合,这进一步显示了三链ＤＮＡ形成的特异性．细胞的生理离子浓度被认为是：Ｓｐ４＋１ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｍｇ２＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｋ＋１４０ｍｍｏｌ／Ｌ,因此,ＣＰ１在细胞内将能特异地与Ｃｐ结合并具有较好的稳定性．     

β珠蛋白基因5′远端新沉默子克隆及定点诱变

通过凝胶滞留分析和荧光素酶报告基因检测系统,鉴定出人类β珠蛋白基因５′旁侧远端帽位上游－２１３２～－１８２２ｂｐ间存在一个活性沉默子片段（３１０ｂｐ）,将其亚克隆至ｐＵＣ－Ｔ载体中,然后采用人工设计的突变引物,将经ＤＮＡ足纹分析确定的两个结合位点的核心基序（β珠蛋白基因帽位上游－２０１７～－２０１１ｂｐ间的“ＣＴＴＣＣＧＣ”序列和－２００６～－１９９７ｂｐ间的“ＣＡＣＴＴＴＡＴＴＴ”序列）分别定点诱变为“ＣＴＴＡＡＧＣ”和“ＣＡＣＴＴＡＡＧＴＴ”两个突变序列,从而构建成两种突变型３１０ｂｐ片段,可用于对活性沉默子位点的结构与功能及β珠蛋白基因表达调控机制的深入研究。     

麦迪霉素产生菌中具强启动活性DNA片段的结构与功能分析

用启动子探针质粒ｐＩＪ４８６从麦迪霉素产生菌（Ｓ．ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ）中克隆到１个具启动功能的ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ２．０ｋｂ片段,含该片段的重组质粒ｐ４Ｈ２转化子在ＭＭ基本培养基上对卡那霉素（Ｋｍ）抗性可达５００μｇ／ｍｌ以上。亚克隆缺失分析结果表明,该片段不同部分的缺失对启动活性有不同程度的影响,说明它具有较复杂的转录调控机制。ＤＮＡ序列分析结果显示,该片段含有１９８４个核苷酸,其Ｇ＋Ｃ％为４７．７％,不存在典型的链霉菌的可读框;进一步的分析发现,其６５０ｂｐ、１１５０ｂｐ和１５００ｂｐ区域分别与麦迪霉素酮基还原酶基因等链霉菌基因的启动子序列具有同源性;在５２０－５７０ｂｐ区域与大肠杆菌ｔＲＮＡ基因上游激活序列（ＵＡＳ）有较好的同源性,提示链霉菌中可能存在可增强基因转录的ＤＮＡ元件。     

HeLa,HepG2,L—02,MCF—7细胞中增殖细胞核抗原启动子的？…

增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的ＤＮＡ聚合酶δ、ε的辅助蛋白,在ＤＮＡ复制修复中起重要作用。用ＰＣＲ方法对人的ＰＣＮＡ启动子的１７个位点进行了８ｂｐ替代突变,并组装到荧光素酶报告基因载体中。通过瞬时转染ＨｅＬａ,ＨｅｐＧ２,Ｌ－０２,ＭＣＦ７细胞株和体外转录方法,发现一些位点是４种细胞都使用的顺式作用元件,一些位点是细胞特异的顺式作用元件。     

传染性法氏囊病病毒中国强毒株A节段cDNA基因的克隆和序列分析

以来自哈尔滨传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ） 强毒株（Ｈａｒｂｉｎ 毒株,Ｈ） 的基因组ＲＮＡ为模板,用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ ＰＣＲ） 的方法得到了其Ａ 节段的全长ｃＤＮＡ 片段,分５＇端（１ ６５９ｂｐ） 和３＇端（１ ４４４ｂｐ） 上下两段分别克隆到ｐＧＥＭＢ○Ｒ － Ｔ 载体上,测定了其核苷酸顺序,在长为３ １０１ ｂｐ 中含有两个阅读框ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ ,分别编码１ ０１２ 个氨基酸的前体蛋白（ＶＰ２ － ４ －３） 和１４５ 个氨基酸的ＶＰ５,ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ 有部分的重叠。将核苷酸序列及推测出的氨基酸序列与已报道的ＩＢＤＶ 血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株的相应序列进行了比较,结果表明：Ｈ 毒株与其它血清Ⅰ型毒株之间,在核苷酸水平上存在２５ｂｐ － ２６７ｂｐ 的差异;在氨基酸水平上存在１７ ～４０ 个氨基酸的差异。在ＶＰ２ － ４ － ３ 内比较显示,Ｈ 毒株与Ｐ２ 、Ｃｕ－ １ 之间氨基酸的差异最小为１ ．７％ ,Ｈ 毒株与ＵＫ６６１ 之间氨基酸的差异最大为３ ．９ ％ 。变异主要发生在ＶＰ２ 的可变区（２０６ － ３５０ 位氨基酸） ,在Ｈ 毒株所特有的１２ 个氨基酸当中,该区就占５ 个,代表１ ．７６ ％ 的变异。ＶＰ４、ＶＰ３ 和ＶＰ５区各有     

牛生长激素基因的人工合成,重组克隆及高效表达

本文通过设计选择大肠杆菌高频利用密码子代替天然密码子,人工全合成３２个寡聚核苷酸片段;连接并克隆获得Ａ（２７８ｂｐ）、Ｂ（８８ｂｐ）、Ｃ（２２４ｂｐ）３个较大ＤＮＡ片段;经重组克隆、定位突变等获得阳性克隆;双向ＤＮＡ序列测定分析表明获得了两种人工全合成牛生长激素（ｂＧＨ）编码基因,即编码Ｎ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－ｂＧＨ和Ｎ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－ｂＧＨ的两个基因,而至今尚未见有人工全合成ｂＧＨ基因的报道。构建了在ＰＬｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下含上述合成基因的表达质位ｐＢＬｂＧＨＥ７Ａ１和ｐＢＬｂＧＨＥ８,并在大肠杆菌中进行了温敏诱导表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达产物占全菌蛋白的３７％以上。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析和纯化产物的Ｎ端氨基酸序列测定结果都表明上述两种人工全合成ｂＧＨ基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量为现今国际文献报道的高限水平。     

用T-A载体克隆技术构建丙肝病毒C+E1区真核表达质粒pSVL-HCV/C+E1

用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩ将丙肝病毒Ｃ＋Ｅ１ＤＮＡ片段从其克隆载体ｐＧＥＭ３ｚｆ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１上切下,经Ｔａｑ酶补齐３’末端后插入到载体ｐＳＶＬ－Ｔ中,构建成丙肝病毒Ｃ＋Ｅ１真核表达载体ｐＳＶＬ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１。本实验中重组效率达６４．７％（１１／１７）,正向插入为５０％（２／４）。     

用核酸免疫技术制备抗丙肝病毒C区单克隆抗体

用丙肝病毒Ｃ＋Ｅ１区真核表达质粒ｐｃＤＮＡ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１按４００ｕｇ／只剂量免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,１４周后同一剂量再加强免疫一次。加强免疫后２周,在５０％ＰＥＧ１４５０介导下将脾细胞与ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞（５１）融合。实验结果融合率达５４．３％（３１３／５７６）。阳性率为５．４％（１７”３１３）。克隆化后得到６株稳定分泌抗丙肝病毒Ｃ区单克隆抗体杂交瘤细胞株。这６株杂交瘤均产生ＩｇＭ抗体,接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠后产生腹水的效价为１６４－１３２０（ＥＬＩＳＡ）。     

人体β—珠蛋白基因5‘旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的…

人β－珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肟和Ｋ５６２细胞中则处于关闭状态,凝胶电泳阻抑法分析发现,在人和肝,成年肝及Ｋ５６２细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β－珠蛋白基因５旁侧调控元件（－３７２到－１９４ｂｐ）相结合的红系组织特生的调控因子。竞争试验的结果表明,成年肝和Ｋ５６２细胞中的调控因子与β－珠蛋白基因５旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相惟性,这两各细胞的调控因子既结合     

两种泥鳅中Sox基因的检出(英文)

性别决定基因ＳＲＹ都具有一个高度保守的基因序列──ＨＭＧ－ｂｏｘ,编码Ｓｏｘ蛋白,在胚胎发育过程中起重要作用。本文利用两种引物检测了泥鳅和大鳞副泥鳅的Ｓｏｘ基因。第一对引物特异扩增人类ＳＲＹ基因的保守区。在扩增泥鳅的基因组ＤＮＡ时可见长度分别为２００、５５０、９４０和１０００ｂｐ的四条扩增带。在大鳞副泥鳅中可以扩增出２００、５５０、９００ｂｐ三条带（Ｆｉｇ．１）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明２００和５５０ｂｐ两条带可以和ＳＲＹ基因探针杂交（Ｆｉｇ．２）。第二对引物是兼并引物,可以特异扩增Ｓｏｘ基因的ＨＭＧ－ｂｏｘ区域。以基因组ＤＮＡ为模板可以在大鳞副泥鳅中扩增出２２０、５５０、７００和１５００ｂｐ四条带（Ｆｉｇ．３）;而在泥鳅中则为２２０、５３０、５７０和１５００ｂｐ四条带（Ｆｉｇ．４）。ＰＣＲ产物的长度差异被认为是由于部分Ｓｏｘ基因的ＨＭＧ－ｂｏｘ区域中存在着内含子。没有发现性别特异扩增带。以上结果说明哺乳动物与性决定有关的组分在脊椎动物中是广泛存在的。但这些组分在鱼类中是否与性决定有关,或仅是哺乳动物性决定因子的进化前体尚不得而知。无论如何广泛深入研究鱼类的Ｓｏｘ基因对于揭示性决定系统和因子的进化方式是十分     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）组合突变体FrGGl在CHO细胞中的…

为了得到ｔ－ＰＡ组合突体ＦｒＧＧｌ在ＣＨＯ细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）去除,构建了ＦｒＧＧｌ真核表达质粒ｐＺＬＦｒＧＧＩ。酶切线化后,采用大剂量ＤＮＡ电击介导法,转染ｄｈｆｒ基因缺陷型中仓鼠卵巢细胞系（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ）。氨甲喋呤（ＭＴＸ）筛选转染细胞,混合加压,挑选克隆,在１×１０＾－７ｍｏｌ／ＬＭＴＸ压力下,获得表达水平达１５００～２５００ＩＵ／１     

氧化诱导K_(562)细胞凋亡机制的初步探讨

以过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）诱导人慢性髓细胞白血病（Ｋ５６２）细胞为凋亡模型,采用流式细胞仪（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ,ＦＣＭ）和激光共聚焦扫描显微镜（ｌａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ,ＬＣＳＭ）研究细胞凋亡,形态观察出现核固缩,核碎裂及凋亡小体等典型凋亡特征．ＤＮＡ电泳图谱出现“Ｌａｄｄｅｒ”．ＦＣＭ检测在Ｇ０／Ｇ１峰前出现一低ＤＮＡ含量的凋亡峰．ＬＣＳＭ显示凋亡细胞ｃ－Ｆｏｓ．ｃ－Ｊｕｎ和ＮＦκＢ表达量均有不同程度的增加．该结果提示上述三种转录因子可能参与氧化诱导凋亡过程中基因的调控作用．     

碳离子诱导的DNA双链断裂

ＤＮＡ双链断裂（ＤＳＢｓ）是电离辐射诱导的最重要的原发损伤,研究ＤＳＢｓ有利于揭示细胞辐射敏感性的机理。用倒转脉冲场凝胶电泳结合荧光扫描进行ＤＮＡ定量研究７５ＭｅＶ／ｕ１２Ｃ６＋对小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞ＤＳＢｓ的诱导,结果表明：ＤＳＢｓ产额约为０．７４ＤＳＢｓ／１００Ｍｂｐ／Ｇｙ;ＤＮＡ片段分布在两个区域。大片段区分子量约为１．４Ｍｂｐ～３．２Ｍｂｐ,分子量小于１．２Ｍｂｐ的为小片段区;并且随着剂量的增加,大片段区ＤＮＡ含量逐渐下降,而小片段区的ＤＮＡ含量显著增加。表明Ｂ１６ＤＮＡ分子上可能存在对重离子较为敏感的位点。     

NMR法研究天花粉蛋白T14肽片段的溶液构象

本文报道用１ＨＮＭＲ法测定Ｔ１４肽在ＤＭＳＯ（ＭＳ１４）,Ｈ２Ｏ（ＨＯ１４）,５０％甲醇（ＭＥ１４）和５０％六氟异丙醇（ＦＰ１４）中的溶液构象。通过ＮＯＥ效应,偶合常数,Ｈ／Ｄ交换速率表征和定位二级结构和疏水域,计算两面角φ和螺旋形成几率。结果表明序列Ｓｅｒ９～Ｔｌｅ１７在ＨＯ１４中较为有序,存在强流水作用。推测是类似螺旋样的亚稳结构;而在ＤＭＳＯ中序列ＳＡＬＳＫＱ存在形成α－螺旋结构的可能性,且六氟异丙醇（ＨＦＰ）促进α－螺旋的稳定性,并综合分析Ｈ２Ｏ,ＤＭＳＯ,ＭｅＯＨ和ＨＦＰ４种溶剂对Ｔ１４肽二级结构形成的作用。     

HFRSV内影像型抗独特型人单抗重链可变区基因克隆

利用反转录－ＰＣＲ方法,从分泌肾综合症出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）内影像型抗独特型人单抗杂交瘤细胞系（Ｃ８）中,成功地克隆了抗ＨＦＲＳＶ１ｄ人单抗重链可变区基因,并将此基因重组入Ｍ１３噬菌体ＤＮＡ中,测定了此重链可变区基因全序列。经计算机分析,基因全长共３５１ｂｐ、编码１１７个氨基酸,氨基酸序列同源性分析发现所推得的该单抗ＣＤＲ２区与ＨＦＲＳＶＧ２蛋白Ｃ端有同源区,此区可能具有较强的抗原性。