用AFLP技术和16S rDNA PCR-RFLP分析毛苜蓿根瘤菌的遗传多样性

采用选择主增片断长度多态性（简称ＡＦＬＰ）ＤＮＡ指纹技术对采自我国云南省与西藏交界的高山地区的野生型豆科植物毛苜蓿根际土样分离的２９１株毛苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｅｄｇｅｗｏｒｔｈｉｉ）根瘤菌进行遗传多样性的研究。从ＡＦＬＰ图谱中,揭示出毛苜蓿根瘤菌有较显著的遗传多样性,从２９１株中选择出９０年代表株用计算机进行树状图的分析。结果表明,所分析的菌株在７９％的相似性水平上聚类成３个群。对这９０年代表     

攀枝花市银合欢根瘤菌遗传多样性

【目的】研究分离自四川攀枝花的银合欢根瘤菌的遗传多样性。【方法】采用联合16S rDNA RFLP和IGS RFLP的综合聚类分析(16S-IGS RFLP)、AFLP及多位点持家基因(16S rDNA,atpD,recA)序列的联合分析对供试银合欢根瘤菌进行研究。【结果】31株未知菌具有15种16S-IGS遗传图谱类型、27种AFLP类型。16S-IGS RFLP结果表明,没有未知菌与Bradyrhizobium的参比菌株聚在一起。在71.4%的相似水平上,31个未知菌按属的水平分成3个分支:S、M和R,分别分布在Sinorhizobium属(28株)、Mesorhizobium属(2株)和Rhizobium属(1株)。S分支的28个菌在84%的相似水平上,16S-IGS RFLP聚类图中构成3个群:群S1、群S2、群S3;在AFLP聚类图中构成9个AFLP群:S1–S9。多位点基因序列表明,代表菌株SCAU215、SCAU231分别与M.Plurifarium、R.huautlense亲缘关系最近。而分布于Sinorhizobium属SCAU222和SCAU228、SCAU213、SCAU216可能代表Sinorhizobium的3个新类群。【结论】攀枝花市银合欢根瘤菌遗传多样性丰富,分布于Sinorhizobium、Mesorhizobium和Rhizobium三个属,且优势类群为Sinorhizobium。     

斜茎黄芪根瘤菌结瘤基因nodA PCR扩增及PCR-RFLP分析

对采自我国北方地区的16株斜茎黄芪根瘤菌代表菌株的共同结瘤基因nodA进行了PCR扩增及PCR-RFLP分析研究。来自Mesorhizobium和Rhizobium系统发育分支的代表菌株都得到了nodA PCR扩增产物;而来自Agrobacterium系统发育分支的代表菌株都没有得到nodA PCR扩增产物。进一步的nodAPCR-RFLP分析结果表明斜茎黄芪根瘤菌具有很大的nodA基因遗传多样性,具有4种不同的16S rDNAPCR-RFLP遗传图谱类型的12株斜茎黄芪根瘤菌具有8种不同的nodA PCR-RFLP遗传图谱类型。但是斜茎黄芪根瘤菌nodA基因遗传多样性随种群而变化,来自M.septentrionale的具有相同的16S rDNA PCR-RFLP遗传图谱类型的4个代表菌株具有4种不同的nodA PCR-RFLP遗传图谱类型;而来自M.tempera-tum的具有相同的16S rDNA PCR-RFLP遗传图谱类型3个代表菌株则具有相同的nodA PCR-RFLP遗传图谱类型。此外,来自不同种的具有不同16S rDNA PCR-RFLP遗传图谱类型的菌株却具有相同的nodA PCR-RFLP遗传图谱类型,说明nodA基因可能在根瘤菌的不同种间发生了水平转移。     

毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌遗传多样性及16S rDNA全序列分析

野生豆科植物中间锦鸡儿是毛乌素沙地的优势种。从蛋白质和DNA水平分析与其共生的根瘤茵的遗传多样性。在蛋白质水平上,24株中间锦鸡儿根瘤菌和9株参比菌株分为2组,A组包含95．8％供试中间锦鸡儿根瘤菌,参比菌株聚为B组,菌株GH72不与其余供试根瘤菌聚类。应用16S　rDNA　PCR—RFLP方法将供试菌株分为22种基因型,中间锦鸡儿根瘤菌组成12种,其余10种由参比菌株构成。表明中间锦鸡儿根瘤菌具高水平遗传多样性。选取代表菌株GH2001进行16S　rDNA全序列测定。与已知相关根瘤菌菌株16S　rDNA进行同源性比较,构建系统发育树状图。GH2001位于Rhizobium分支,与且Agrobacterium radiobacter,Ag.rubi,Rhizobium giardinii,R.mongolense,R.yanglingense,R.galegae和R.huautlense的序列同源性分别达到99％、98．3％、96．3％、95．5％、95．6％、95．27％和95．7％。     

用AFLP技术研究花生根瘤菌的遗传多样性

采用AFLP分子标记技术,对分离自中国、津巴布韦、以色列的133株慢生花生根瘤菌(\%Bradyrhizobium \%sp.\%arachis)\%和13个代表菌株(\%Bradyrhizobium japonicum. Bradyrhizobium elkanii)\%的DNA扩增长度多态性进行了分析,并根据各供试菌株的遗传相似性进行了数值聚类。结果表明慢生花生根瘤菌群体内存在很高的遗传多样性,每个菌株的AFLP带谱均与其它菌株完全不同。AFLP技术简便、快速、重现性极高,能表现高信息量的DNA长度多态性,是目前研究生物群体内遗传多样性的最有效办法。     

沙冬青根瘤菌遗传多样性和系统发育分析

利用16S rDNA RFLP、16S-23S rDNA RFLP和16S rDNA序列分析方法,对分离自宁夏和内蒙古阿拉善地区的沙冬青根瘤菌进行了遗传多样性和系统发育分析.结果表明,分离自不同地区沙冬青根瘤菌的44株测试菌株分别归属于中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、叶杆菌属 (Phylobacterium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)5个属种.受寄主和地理环境因素的影响,沙冬青根瘤菌具有丰富的遗传多样性.     

兰坪铅锌尾矿区豆科根瘤菌遗传多样性ARDRA分析

通过16S rDNA扩增产物限制性片段长度多态性分析(ARDRA),对兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌的遗传多样性进行了研究。采用限制性内切酶Hae Ⅲ、Hind Ⅲ、Hinf Ⅰ和Taq Ⅰ对16S rDNA扩增产物进行了酶切分型,根据ARDRA酶切图谱的不同,进行树状聚类。结果表明:49株根瘤菌在40%的相似水平上按氮含量不同及铅锌含量的采集地不同分别聚为OTU1、OTU2和OTU33个群,说明根瘤菌的遗传多样性及分布与土壤中的氮含量和铅锌含量有关。代表菌株的16S rDNA测序结果分析表明,它们在系统发育树上属于Rhizobium sp.、Sinorhizobium sp.和Bradyrhizobium sp.3个系统发育分支,进一步说明兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌多样性较丰富。     

根瘤菌新类群代表菌株的16S rDNA全序列测定及其系统发育地位

用双脱氧法测定了一个根瘤菌新类群代表菌株SH2672的16S rDNA全序列,将此全序列与根瘤菌各已知种及相关种的16S rDNA全序列进行了比较及聚类分析,得到系统发育树状图。在系统发育树状图中,菌株SH2672与百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti),华癸中慢生根瘤菌(M. huakuii)、天山中慢生根瘤菌(M. tianshanense)、地中海中慢生根瘤菌(M. mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(M. ciceri)共同构成一个分支,与各已知种的模式菌株16S rDNA相似性分别为:96.3％,96.4％,97.2％,95.1％,95.6％,均在95％以上,它们应归属于同一属。且分支内各种间DNA同源性低于70％,表明它们分别为不同的种,菌株SH2672代表着一个新的根瘤菌种。     

黑木相思根瘤菌遗传多样性

[目的]研究分离自广东、福建、江西等15个地点的174株黑木相思(Acacia melanoxylon)根瘤菌的遗传多样性.[方法]采用16S rDNA限制性片段长度多态性分析(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)和16S rDNA基因、持家基因(recA、atpD、glnⅡ)系统发育分析的方进行研究.[结果]16S rDNAPCR-RFLP分析中,在70％的相似性水平上,所有供试菌株分成9个类群 ;16S rDNA基因和持家基因系统发育分析结果基本一致,34株代表菌株主要分布在α-变形菌纲(Alpha-Proteobacteria)的慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、根瘤菌属(Rizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium),并与Bradyrhizobium liaoningense、Bradyrhizobium betae、Bradyrhizobium cytisi、Rizobium multihospitium、Mesorhizobium plurifarium亲缘关系较近.[结论]供试菌株被鉴定到属的水平,Bradyrhizobium、Rhizobium或Mesorhizobium为优势菌群,证明了黑木相思根瘤菌具有丰富的遗传多样性.     

陕西太白尾矿废弃地豆科植物根瘤菌16S rDNA PCR-RFLP及全序列分析

应用16S rDNA-RFLP和16S rDNA全序列测定方法,对分离自陕西太白金矿尾矿废弃地的55株根瘤菌和12株参比菌株进行了遗传多样性和系统发育地位研究。采用平均连锁法(UPMGA)对16S rDNA PCR-RFLP聚类,结果显示所有菌株在72%的水平上聚到一起。根据参比菌株的种属关系,将供试菌株初步分成6个遗传发育群。群Ⅰ为根瘤菌属,群Ⅱ为中华根瘤菌属,群Ⅲ是中慢生根瘤菌属,群Ⅳ为土壤杆菌属,群V为一未知群,群Ⅵ为慢生根瘤菌属。分离自天蓝苜蓿的根瘤菌主要分布在群Ⅱ,截叶胡枝子根瘤菌在各个群内均有分布,表现出丰富的遗传多样性。选取群Ⅰ、Ⅱ的代表菌株TB17-1、TB50-1进行16S rDNA全序列测定分析,结果显示TB17-1与Rhizonbium leguminosarumUSDA2370的同源性高达99.7%,TB50-1与Sinorhizobium melilotiLMG6133的同源性为100%。全序列测定结果与RFLP分析结果基本一致。     

我国南北大豆产区慢生大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育研究

利用16S rRNA基因RFLP、16S rRNA基因序列分析以及16S-23S rRNA IGS PCR RFLP技术对分离自我国南北大豆产区的慢生大豆根瘤菌进行了群体遗传多样性和系统发育研究。16S rRNA基因PCR RFLP分析以及16S rRNA基因序列分析结果表明:所有供试慢生大豆根瘤菌可分为B.japonicum和B.elkanii两个类群,其中属于B.japonicum的为优势种群,占供试菌株的91%,属于B.elkanii的仅占9%,多样性水平较低。16S-23S rRNA IGS PCRRFLP研究结果表明:属于B.japonicum的慢生根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,在69%的相似性水平上可分为群Ⅰ和群Ⅱ两大类群。群I的菌株以分离自黑龙江和河北等北部区域的菌株为代表,群Ⅱ的菌株以分离自广西和江苏等南部地域的菌株为代表,反映出明显的地域特征。两群菌株在系统发育上均与USDA6、USDA110和USDA122等B.japonicum的模式或代表菌株有差异。     

海绵Pachychalina sp.体内细菌多样性的研究

通过非分离培养分析方法,直接从海绵体内提取细菌总DNA。以样品总DNA为模板进行PCR扩增获得细菌16S rDNA。用16S rDNA限制性酶切片段长度多态性（ARDRA）和测序方法对南海湛江海域海绵Pachychalina sp.体内的细菌多样性进行了研究。在细菌16S rDNA的ARDRA图谱中,大多数克隆的酶切带谱间存在差异;随机挑选22个克隆进行测序得到它们的16S rDNA部分序列,大部分序列属于γproteobacterium和αproteobacterium,但有少数克隆序列与RDP数据库中收录的16S rDNA序列间的相似性极小,不参与系统发育树的构建。研究结果表明海绵Pachychalina sp.体内细菌组成具有丰富的多样性。     

黄土高原地区大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育

【目的】研究黄土高原地区大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育。【方法】采用BOX-PCR、16S rDNAPCR-RFLP、16S-23S IGS PCR-RFLP和16S rRNA基因序列分析方法对分离自我国黄土高原地区4个省的15个地区的130株大豆根瘤菌及部分参比菌株进行了遗传多样性和系统发育分析。【结果】BOX-PCR反映的菌株多样性最丰富,形成的遗传群最多,16S rDNA PCR-RFLP方法在属、种水平上聚群较好,16S-23S IGSPCR RFLP反映的多样性介于BOX-PCR和16S rDNA PCR-RFLP之间,能够较好地反映出属、种和亲缘关系很近的菌株间的差异,3种方法聚类分析结果基本一致,可将所有供试菌株分为两大类群,中华根瘤菌属(Sinorhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)。从系统发育来看,供试的快生大豆根瘤菌为费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii),慢生大豆根瘤菌为日本慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)和辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)。【结论】我国黄土高原地区大豆根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,S.fredii优势种,慢生大豆根瘤菌仅占10%,同时,分离到2株B.liaoningense。     

花生根瘤菌群体遗传多样性和系统发育研究

利用16S rRNA RFLP,16S rRNA序列分析和16S－23S IGS PCR RFLP技术对43株花生根瘤菌和来自其他种属的15个参比菌株进行了群体遗传多样性和系统分析。16S rRNA PCR RFLP分析结果表明,所有供试花生根瘤菌均属于慢生根瘤菌属,在系统发育上与B.japonicum的亲缘关系最近,具有相同的16S rRNA RFLP基因型,而与B.elkanii相对较远。16S rRNA 序列分析结果表明,供试花生根瘤菌在系统发育上更接近于B.liaoningense,序列间差异小于1％,而B.liaoningense在系统发育上与B.japonicum相距很近,其序列间差异小于1％,16S－23S rRNA IGS RFLP分析结果表明,尽管花生根瘤菌与B.japonicum和B.elkanii的亲缘关系很近,但在71％的相似性水平上供试花生根瘤菌仍各自聚为一群,并可进一步分为A、B、C和D4个亚群,该分群还明显反映了地理因素对群体遗传多样性和系统发育的影响。     

海绵Pachychalina sp.体内古菌多样性非培养技术分析

采用非分离培养分析方法,即16S rDNA限制性酶切片段长度多态性（ARDRA）和测序方法对南海湛江海域海绵Pachychalina sp.体内的古菌多样性进行了研究。从海绵体内直接提取古菌总DNA。以样品总DNA为模板,用古菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增获得16S rDNA,回收、纯化16S rDNA产物并克隆到TVector。进行第二次PCR扩增反应,且对扩增产物进行ARDRA。在古菌16S rDNA的ARDRA图谱中,大多数克隆的酶切带谱上存在差异;随机挑选8个克隆子进行测序,获得古菌16S rDNA的部分序列,并对16S rDNA序列进行聚类分析构建了系统进化树,结果发现海绵体内的古菌主要属于Methanogenium organophilum、Methanoplanus petrolearius等古菌类。但它们与目前数据库中收录的古细菌间的相似性均不超过90%,它们极有可能是一些新的古菌。     

西北地区天蓝苜蓿根瘤菌16S rDNA RFLP分析

利用RFLP和序列测定方法,对分离自西北地区的67株天蓝苜蓿根瘤菌16S rDNA进行了分析研究。结果表明:所有供试菌株分别归属于中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)和土壤杆菌属(Agrobac-terium)。以CCNWNX0042-2为代表的大部分天蓝苜蓿根瘤菌属于草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti),其余菌株在分群上表现出了较为明显的地域特征。     

苜蓿中华根瘤菌042BMnoeA基因的克隆、敲除与功能的初步分析

通过PCR扩增获得了042BM的noeA基因。该基因与苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)1021noeA的同源性为99%,而其NoeA与1021NoeA的相似性为97%。还发现其NoeA与中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp.）BNC1可能的SAM_依赖性的甲基转移酶相似性为32%,而其303～362氨基酸区域与大肠杆菌（Escherichia coli）的核糖体50S亚基的L11蛋白甲基转移酶(PrmA)的160～220氨基酸区域的相似性达到41%。通过插入卡那盒,敲除noeA,获得突变株042BMA_Km。与苜蓿中华根瘤菌042BM相比,敲除noeA的突变株在普通紫花、保定、宁夏、百发和傲汉苜蓿品种上的结瘤数、根瘤鲜重和植株地上部分的干重都有不同程度的增加,而在秘鲁苜蓿品种上的结瘤数和植株地上部分的干重明显下降,在皇后和美国杂花苜蓿品种上则没有明显的变化。     

斜茎黄芪根瘤菌谷氨酰胺合成酶基因多样性研究

研究了22株代表性斜茎黄芪根瘤菌的谷氨酰胺合成酶基因多样性。首先对供试菌株进行了谷氨酰胺合成酶glnA和glnII基因扩增,结果显示从来自Mesorhizobium和Rhizobium属的多数代表菌株都可以扩增到约1kp、大小一致的glnA基因产物,而从Agrobacterium sp.的4株代表菌株未能得到glnA PCR扩增产物。基因glnII的扩增结果显示几乎从所有测试菌株都能够得到基因产物,来自Mesorhizobium septentrionale、M.temperatum和Mesorhizobium spp.的代表菌株都得到了单一的、大小约400bp～500bp的glnII PCR扩增产物,而从Agrobacterium sp.的4株代表菌株扩增得到的glnII PCR扩增产物明显不同于其它斜茎黄芪根瘤菌代表菌,它们都有一条约1 kb的特征PCR扩增产物条带,SDW052和R084还出现了另外2～3个扩增产物条带。此外,基因glnA的RFLP分析结果与我们先前的16S rRNA基因分析结果具有很好的一致性,这些结果都进一步证实了这些根瘤菌的染色体基因多样性。     

华北及西北地区岩黄芪根瘤菌的表型及遗传多样性

选用分离自河北、内蒙古等5省区的岩黄芪根瘤菌30株及17株已知参比菌株,进行了营养利用、抗生素抗性、耐逆性及生理生化反应等12 5项表型性状研究,所得数值分类树状图表明不同宿主及不同地域的岩黄芪根瘤菌的表型多样性。通过对其中部分菌株进行16 S r DNA PCR- RFL P及BOX- PCR指纹图谱分析,聚类结果表明供试岩黄芪根瘤菌具有遗传多样性。     

根瘤菌新类群代表菌株的16SrDNA全序列测定及其系统发育地位

用双脱氧法测定了一个根瘤菌新类群代表菌株SH2672的16S rDNA全序列,将此全序列与根瘤菌各已知种及相关种的16S rDNA全序列进行了比较及聚类分析,得到系统发育树状图。在系统发育树状图中,菌株SH2672与百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti),华癸中慢生根瘤菌(M. huakuii)、天山中慢生根瘤菌(M. tianshanense)、地中海中慢生根瘤菌(M. mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(M. ciceri)共同构成一个分支,与各已知种的模式菌株16S rDNA相似性分别为:96.3％,96.4％,97.2％,95.1％,95.6％,均在95％以上,它们应归属于同一属。且分支内各种间DNA同源性低于70％,表明它们分别为不同的种,菌株SH2672代表着一个新的根瘤菌种。