巴西橡胶树HbMyb1基因的原位PCR物理定位

为探讨巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)死皮病抗性相关HbMyb1基因的定位,采用所建立的橡胶树染色体原位PCR技术体系进行研究。结果表明,HbMyb1基因初步定位于巴西橡胶树‘热研7-33-97’的第5号染色体长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离为15.21,并观察到在巴西橡胶树‘热研7-33-97’叶片细胞核的不同分裂时期均扩增到1~2个信号。同时对染色体标本的制备、保存、预处理等方面进行了探讨。     

巴西橡胶树橡胶生物合成关键基因REF,SRPP,HRT1和HRT2的表达分析

橡胶延长因子REF、小橡胶粒子蛋白SRPP、橡胶转移酶HRT1和HRT2是巴西橡胶树胶乳中的主要橡胶粒子蛋白,它们在橡胶生物合成中发挥重要作用,与橡胶树胶乳产量密切相关。为进一步探明REF、SRPP、HRT1和HRT2的基因表达与橡胶树胶乳产量之间的关系,以成龄未开割橡胶树无性系热研7-33-97胶乳为材料,通过实时荧光定量PCR的方法,对割胶伤害、外源乙烯利和茉莉酸刺激的处理条件下,橡胶树胶乳中的REF、SRPP、HRT1和HRT2的基因表达进行了分析。结果表明,随着割胶刀次的增加,REF基因在第4刀的表达量最高,而SRPP、HRT1和HRT2基因则在第6刀表达量达到最高;而在乙烯利和茉莉酸刺激处理下,REF、SRPP、HRT1和HRT2基因均在刺激8 h后表达量达到最高。因此,割胶(机械伤害)、外源乙烯利和茉莉酸刺激促进橡胶树产胶可能与它们提高橡胶生物合成相关橡胶粒子蛋白REF、SRPP、HRT1和HRT2的基因表达具有密切关系。     

应用酵母双杂交系统筛选橡胶延长因子REF的互作蛋白

利用酵母双杂交系统,以橡胶树(Hevea brasiliensis)橡胶延长因子基因REF的开放阅读框(ORF)构建无自激活性的诱饵表达载体pBD-GAL4-REF,并筛选以pAD-GAL4-2.1载体构建的橡胶树胶乳cDNA文库,对阳性克隆的cDNA插入片段进行测序及生物学功能分析。通过酵母双杂交筛选,共获得5种可能与REF互作的候选蛋白质,它们分别为与诱饵蛋白REF高度同源的REF家族成员、小橡胶粒子蛋白(SRPP)、翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)、激发子响应蛋白和泛素耦联酶E2,这表明橡胶延长因子REF除了与自身高度同源蛋白质可能存在相互作用之外,还可能与TCTP和激发子响应蛋白等其它蛋白质发生相互作用。这些结果有助于揭示橡胶粒子的生物学功能。     

不同提取液对巴西橡胶树橡胶粒子蛋白质提取和分离的影响

橡胶粒子是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）乳管细胞内进行橡胶生物合成的亚细胞结构;对橡胶粒子的蛋白质组学研究,可为揭示天然橡胶生物合成机理提供线索。采用5种提取液分别提取橡胶粒子蛋白,并对橡胶粒子蛋白进行SDS—PAGE和16-BAC／SDS—PAGE电泳分离及MALDITOF／TOF串联质谱分析,证明不同提取液抽提的橡胶粒子蛋白具有不同组成,发现分子量较高的橡胶延伸因子家族蛋白更难从橡胶粒子上被洗脱和提取。通过检索橡胶树转录组数据库,鉴定了3个新的橡胶粒子蛋白,即醌氧化还原酶、含蓖麻毒素B链凝集素结构域蛋白及枯萎／脱水相关蛋白。本研究建立的橡胶粒子蛋白质提取和分离方法,为进一步鉴定低丰度和具有重要功能的橡胶粒子蛋白提供了参照体系。     

采用酵母双杂交系统筛选橡胶树HbTCTP1互作蛋白

翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一种在生物体中普遍存在和结构上高度保守的多功能蛋白。本研究以橡胶树Hb TCTP1基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)作为诱饵,采用酵母双杂交系统构建筛选Hb TCTP1互作蛋白的诱饵表达载体p BD-GAL4-Hb TCTP1,并在p ADGAL4-2.1质粒构建的橡胶树胶乳cDNA文库中筛选Hb TCTP1互作蛋白。将获得的两个与Hb TCTP1互作的阳性克隆进行测序,比对NCBI非丰富蛋白数据库发现:它们分别是橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)和60S核糖体L44蛋白(60S ribosomal protein L44,RPL44)。本研究结果对进一步揭示Hb TCTP1在橡胶树中的作用具有重要意义。     

海南岛巴西橡胶和香蕉cat相关基因的克隆及分析

根据GenBank上已有的植物cat基因序列,设计一对兼并引物。在海南岛采集香蕉、巴西橡胶、黄灯笼辣椒、菠萝、甘蔗、番木瓜等作物的叶片并提取总RNA,反转录成cDNA,PCR进行同源克隆。结果获得了巴西橡胶cat-1和香蕉的cat-2基因,而未获得其它4种作物cat相关基因。序列分析发现,巴西橡胶cat-1和香蕉的cat-2基因开放阅读框(ORF)都为1 479 bp,编码492个氨基酸,GenBank登陆号分别为HQ660587和HQ660588。生物信息学软件分析巴西橡胶CAT-1和香蕉CAT-2蛋白的三级结构分别与Exiguobacteriu Oxidotolerans(PDB code：2j2mA0)和Pseudomonas Syringae(PDB code：1m7sA)相似。构建系统发育树表明巴西橡胶CAT-1与蓖麻CAT-1氨基酸序列(Ricinus communis:XP_002521709.1)同源性最高,为92.1%;香蕉CAT-2与油棕CAT-2氨基酸序列(Elaeis guineensis:ACF06566.1)同源性最高,达90.9%。     

橡胶树乳管细胞中与HbMADS4互作蛋白的筛选

MADS-box转录因子在植物的生长发育、花器官的形成、信号传导、参与次生代谢物合成等方面发挥重要的作用。在前期研究中我们获得了一个在橡胶树自根幼态无性系和供体胶乳中差异表达的MADS-box转录因子基因HbMADS4,初步发现HbMADS4负调控小橡胶粒子蛋白基因(HbSRPP)的表达。为深入研究HbMADS4的生物学功能,以HbMADS4为诱饵蛋白,利用酵母双杂交从橡胶树胶乳cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。通过阳性克隆的筛选、复筛、回转验证和生物信息学分析,初步获得了10个与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白。对这些靶蛋白的功能分析,将为进一步研究HbMADS4在橡胶树乳管细胞中的生物学功能提供重要信息。     

巴西橡胶树HbHEV3基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,通过RT-PCR获得了一个编码橡胶素前体的基因,命名为HbHEV3。HbHEV3编码区cDNA长度为630bp,编码209个氨基酸。预测的HbHEV3蛋白包含1个信号肽,1个具有几丁质结合特性的Hevein结构域和1个Barwinn结构域,HbHEV3与橡胶树及其他植物中类似蛋白具有很高的同源性。分离获得了HbHEV3起始密码子上游1 050bp的启动子序列,该序列含有众多应答激素和胁迫信号元件。实时荧光定量PCR分析结果表明,HbHEV3在所检测的组织中均有表达,其中在胶乳中的表达量最高,乙烯诱导能显著上调胶乳中HbHEV3的表达。研究表明,HbHEV3可能参与了橡胶树乙烯介导的防御反应,并在橡胶凝集过程中具有重要功能。     

一株橡胶降解菌Rhizobacter gummiphilus NBRC109400的全基因组测序及功能挖掘

Rhizobacter gummiphilus NBRC 109400是一种新发现的具有降解天然橡胶能力的革兰氏阴性菌,为进一步探究该菌株降解天然橡胶的作用机制,挖掘菌株可能存在的功能特性,本研究使用第三代高通量测序技术对R. gummiphilus NBRC 109400进行全基因组测序,基于完成图进行基因预测、功能注释以及次级代谢产物合成基因簇预测,并对其橡胶降解蛋白进行挖掘。该菌株基因组大小为6 398 100 bp,GC含量为69.72%。该基因组共预测得到9个次级代谢产物合成基因簇,其中2号基因簇与来自菌株Delftia acidovorans SPH-1的delftibactin金生物矿化基因簇同源并进行了探究。定位了该菌株的橡胶降解关键蛋白LatA橡胶加氧酶,同时,预测到一个可能与菌株降解橡胶途经相关的同工蛋白CPZ87_07230。全基因组序列已提交至美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库,登录号为CP024645。以上研究将为菌株NBRC 109400的功能基因组学研究及橡胶降解特性研究提供基础数据。     

定量蛋白质组学筛选及分析山慈菇酯提物抗4T1乳腺癌的新启示

探讨山慈菇酯提物(ethyl acetate extract of Cremastra appendiculata,Cr Ap)作用于4T1乳腺癌癌组织中差异蛋白的表达变化,筛选Cr Ap抗4T1乳腺癌的靶点。采用定量蛋白质组学串联质量标签(TMT)标记技术对Cr Ap作用的4T1乳腺癌癌组织进行检测,并筛选4T1组织中发生显著变化的差异蛋白。利用多重数据库对Cr Ap/CON差异蛋白进一步进行生物信息学分析,QPCR检测癌组织中Ly6G、S100a8、S100a9、Tmsb4x和GADPH的mRNA表达量。蛋白质组学共获得15个上调蛋白,1个下调蛋白,其中有4个上调差异蛋白与免疫调节功能密切相关。胸腺素β-4下调,而Toll 4受体结合蛋白、Toll样受体结合蛋白、肥大细胞表达膜蛋白1上调,基因本体论注释分析和功能聚类分析显示这些差异蛋白可能与Cr Ap产生抗乳腺癌作用相关;S100-a8、S100-a9蛋白上调可能与Cr Ap产生促凋亡作用和免疫调节过程相关。此外,KEGG富集通路多与免疫调控过程相关,其中癌症的转录失调通路、IL-17信号通路可能与Cr Ap抗4T1作用和免疫调节机制密切相关。QPCR结果显示Cr Ap能显著提高乳腺癌组织中Ly6G、S100a8、S100a9的表达,而降低Tmsb4x。TMT定量蛋白质组学能有效筛选Cr Ap抗4T1的差异蛋白,其中Cr Ap抗4T1乳腺癌机制和相关的免疫调控作用有望成为新的研究方向。     

橡胶树死皮病胶乳C-乳清差异表达蛋白质的筛选与鉴定

橡胶树死皮病(Tapping Panel Dryness,TPD)在世界各橡胶种植园普遍发生,给橡胶种植业带来严重的危害。为了更好地了解和阐明死皮病发生、发展的分子机制,本研究应用双向凝胶电泳技术（2-DE）比较橡胶树死皮株与健康株胶乳C-乳清蛋白质组表达的差异。采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离橡胶树死皮株与健康株C-乳清的总蛋白质,凝胶经考染显色后,用PDQuest7.40图像分析软件进行比较分析,识别差异表达的蛋白质。这些点经过胶内酶切后进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质指纹图谱(PMF),Mascot软件搜索SWISS-PROT和NCBInr数据库鉴定蛋白质。结果：①橡胶树死皮株与健康株C-乳清凝胶的平均蛋白质点数分别为1075±35和1134±27,其平均匹配的点数分别为982±38和1008±22,组内图像匹配率达91.89﹪和88.72﹪。②橡胶树死皮株与健康株C-乳清组间的平均匹配蛋白点数为970±25。利用MALDI-TOF-MS质谱技术对40个差异明显的蛋白点进行分析鉴定,通过查询数据库鉴定了27个蛋白质。本研究建立了分辨率高且重复性较好的橡胶树死皮株与 健康株胶乳C-乳清的双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定了其中表达差异的蛋白质点,这些差异表达的蛋白质可能参与了死皮发生和发展的过程。     

利用巴西橡胶树寡核苷酸芯片筛选死皮相关基因

以健康和死皮巴西橡胶树品系热研7．33—97树皮为实验材料,利用定制橡胶树寡核苷酸芯片筛选橡胶树死皮相关基因。在橡胶树寡核苷酸芯片包含的566个基因中,死皮与健康树树皮差异表达倍数在2倍或2倍以上的有56个,占筛选转录本总数的9．9％。在56个死皮相关基因中,死皮树中上调表达基因有3个,下调表达基因有53个。这些死皮相关基因共涉及8个功能分类,“抗性及防御反应”所占比例最高,接下来是“蛋白质合成、加工及转运”和“代谢和能量”,以上三类功能基因占66．07％。此外,死皮相关基因还涉及“细胞结构、生长及分化”、“细胞信号转导”、“转录相关”、“橡胶生物合成”和“未知功能”。为验证芯片结果的可信性,随机选取18个基因进行RT-PCR分析,结果表明被检测基因表达模式均与芯片结果完全一致。本研究鉴定并分析了死皮相关基因,为进一步揭示橡胶树死皮发生机制奠定了基础。     

死皮对橡胶树树皮线粒体超微结构及活性氧代谢的影响

为了解析橡胶树（Hevea brasiliensis）死皮的发生机制,有效进行死皮防治,以健康、轻度死皮、重度死皮橡胶树树皮为材料,研究死皮发生过程中树皮线粒体超微结构变化规律及活性氧（ROS）相关基因的表达模式变化。结果表明：死皮树线粒体超微结构发生不规则形变,膜内基质溶解,嵴消失,内腔空泡化等,且严重程度与死皮严重程度成正比。荧光定量PCR结果表明,过氧化物酶基因HbPOD2和HbPOD3在死皮树中的表达量高于健康树,可作为监测割胶强度、刺激强度和死皮发生的“标志”基因。植物细胞重要ROS清除酶过氧化氢酶基因HbCAT在死皮树中也下调表达,预示ROS产生与清除之间的平衡是影响橡胶树死皮发生的关键因素。橡胶树中重要抗氧化代谢物基因表达结果表明,HbGST1、HbGST2和HbPPO在死皮树中的表达量均高于健康树,可能与死皮发生过程胶乳原位凝固相关。本研究通过揭示死皮发生过程树皮超微结构和ROS相关基因表达模式变化,为阐明橡胶树死皮发生机制提供新观点,同时为进一步开发监测割胶强度、刺激强度和死皮发生的基因“标志”提供理论基础。     

Identification and characterization of genes associated with tapping panel dryness from <Emphasis Type="Italic">Hevea brasiliensis</Emphasis>latex using suppression subtractive hybridization

Background  

Tapping panel dryness (TPD) is one of the most serious threats to natural rubber production. Although a great deal of effort has been made to study TPD in rubber tree, the molecular mechanisms underlying TPD remain poorly understood. Identification and systematical analyses of the genes associated with TPD are the prerequisites for elucidating the molecular mechanisms involved in TPD. The present study is undertaken to generate information about the genes related to TPD in rubber tree.     

Identification of PLP2 and RAB5C as novel TPD52 binding partners through yeast two-hybrid screening

Tumor protein D52 (TPD52) is overexpressed in different cancers, but its molecular functions are poorly defined. A large, low-stringency yeast two-hybrid screen using full-length TPD52 bait identified known partners (TPD52, TPD52L1, TPD52L2, MAL2) and four other preys that reproducibly bound TPD52 and TPD52L1 baits (PLP2, RAB5C, GOLGA5, YIF1A). PLP2 and RAB5 interactions with TPD52 were confirmed in pull down assays, with interaction domain mapping experiments indicating that both proteins interact with a novel binding region of TPD52. This study provides insights into TPD52 functions, and ways to maximise the efficiency of low-stringency yeast two-hybrid screens.     

巴西橡胶树一个AP2／EREBP转录因子的克隆及表达分析

本文采用RACE技术从巴西橡胶树中鉴定出一个AP2／EREBP转录因子。该转录因子全长cDNANl225bp,最长开放阅读框699bp,预测编码蛋白包含232个氨基酸;序列比对分析发现,该转录因子具有一段保守的AP2／EREBP结构域,与拟南芥Soloist（At4g13040）具有较高的相似性,将该基因命名HbSoloist。半定量胙PcR分析结果表明,HbSoloist在巴西橡胶树的胶乳、叶片、树皮和花中均有表达。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳HbSoloist表达量明显下降。研究发HbSoloist表达受乙烯利、茉莉酸和低温处理调控,表明HbSoloist基因可能在巴西橡胶树乙烯、茉莉酸和低温反应中发挥作用。     

A testis-specific and testis developmentally regulated tumor protein D52 (TPD52)-like protein TPD52L3/hD55 interacts with TPD52 family proteins

Tumor protein D52-like proteins (TPD52) are small coiled-coil motif bearing proteins that were first identified in breast cancer. TPD52 and related proteins have been implicated in cell proliferation, apoptosis, and vesicle trafficking. To date, three human TPD52 members had been identified, named hD52 (TPD52), hD53 (TPD52L1), and hD54 (TPD52L2). The most important characteristic of the protein family is a highly conserved coiled-coil motif that is required for homo- and heteromeric interaction with other TPD52-like proteins. Herein, we identified a novel TPD52-like sequence (TPD52L3, or hD55) in human testis using cDNA microarray. Sequence analysis of the deduced protein suggests that hD55 contains a coiled-coil motif and is highly conserved compared with other TPD52-like sequences. Yeast two-hybrid and GST pull-down assays revealed that hD55 interacts with hD52, hD53, hD54, and itself. cDNA microarray detection found that hD55 was expressed at 5.6-fold higher levels in adult testis than in fetal testis. Additionally, the expression profile shows that hD55 is testis-specific, indicating a potential role for hD55 in testis development and spermatogenesis.