新型七甲川菁染料用作肿瘤模型活体成像的研究进展

一种近红外荧光(NIRF)七甲川菁染料不需要化学修饰,可直接被肿瘤细胞吸收呈特异性聚集,从而可用于肿瘤活体成像。这种染料在肿瘤细胞与正常细胞之间的摄取差异可能是由于特异型有机阴离子转运肽的作用,并受到低氧条件控制。这些特性将会拓展NIRF类染料在肿瘤成像研究中的应用。     

七甲川花菁染料作为肿瘤靶向和光动力治疗载体的研究进展

七甲川花菁近红外荧光染料(NIRF)可直接被肿瘤细胞特异性吸收,具有肿瘤靶向性。与化疗药物偶联后,该类染料可通过血脑屏障将药物转运至肿瘤部位,不仅可以减少化疗药物使用剂量,降低药物的毒副作用,也可通过近红外荧光成像实现对肿瘤治疗的实时监控。七甲川花菁染料所展示的线粒体毒性和光敏特性,可直接杀死肿瘤细胞,抑制肿瘤新生血管的形成。通过纳米包裹,能够显著增强该类染料的肿瘤靶向能力,实现实时跟踪药物释放情况。七甲川花菁染料特异性识别肿瘤细胞的能力与有机阴离子转运肽的作用密切相关,缺氧和线粒体膜电位也参与了染料吸收的调控。这些发现有利于将近红外荧光染料应用于肿瘤的靶向治疗。     

FTS与NIRF共轭化合物用于小鼠肿瘤模型的成像和治疗

目的研究法尼基硫代水杨酸(farnesylthiosalicylic Acid,FTS)与七甲川菁(heptamethine carbocyanine)近红外(near infrared,NIR)荧光染料共轭化合物的肿瘤靶向性及其在活体成像中的应用,明确该化合物对肿瘤生长的抑制作用。方法将人乳腺癌细胞MCF-7、胶质瘤细胞U251和前列腺癌细胞PC3培养至对数生长期后,分别加入不同浓度的FTS和FTS-IR783,观察两种化合物对肿瘤细胞的生长抑制作用;培养的三种肿瘤细胞中加入FTS-IR783(20μmol/L),荧光显微镜下观察荧光染料在肿瘤细胞中的聚集;将三种肿瘤细胞(每只1×10~6个)皮下移植裸鼠,两周后荷瘤鼠腹腔注射FTS-IR783(每只10 nmol/L),活体成像分别测定肿瘤部位近红外荧光信号和肿瘤体积的相关性。结果与FTS相比较,FTS-IR783可显著抑制MCF-7、U251和PC3的生长;三种肿瘤细胞可特异性识别FTS-IR783,呈现近红外荧光集聚;皮下荷瘤模型注射FTS-IR783后,活体成像显示肿瘤部位荧光强度与生物发光强度相关性分别达到0.987,0.998和0.971。结论 FTS与近红外荧光染料IR-783共轭结合后可特异性识别肿瘤细胞,用于肿瘤模型的活体成像,同时该化合物具有的肿瘤靶向性可显著抑制肿瘤细胞的生长,有望成为新型的靶向药物。     

近红外荧光染料在胃癌人源性肿瘤组织异种移植模型研究中的应用

目的建立胃癌人源性肿瘤组织异种移植(patient-derived tumor xenograft,PDX)裸鼠模型,探讨近红外荧光(near infrared fluorescence,NIRF)染料IR-783在胃癌PDX模型活体成像研究中的应用。方法取临床胃癌新鲜手术切除标本,裸鼠肾包膜移植建立PDX模型,HE染色比较移植肿瘤组织与患者肿瘤组织形态结构的一致性。将移植肿瘤组织裸鼠皮下接种,20 d后,荷瘤小鼠腹腔注射NIRF染料IR-783(每只10 nmol/L),活体成像连续测定肿瘤部位近红外荧光强度并分析肿瘤体积与荧光强度的相关性;免疫组织化学检测移植肿瘤组织中HIF1α与OATP1B3的表达强度。结果成功建立了3个人胃癌PDX模型,移植肿瘤组织较好的保持了原发肿瘤的特征,NIRF活体成像早期检测到肾包膜部位荧光信号。PDX模型中肿瘤体积与荧光强度的相关性均在98%以上。移植肿瘤组织中HIF1α与OATP1B3表达呈强阳性。结论 NIRF染料IR-783可在PDX模型肿瘤部位特异性聚集,用于PDX模型的早期检测,这种肿瘤靶向性可能与HIF1α和OATP1B3的表达相关。     

基于近红外荧光制剂的多模态多功能分子影像技术在肿瘤模型中的应用

多模态融合的分子影像技术整合了多种分子影像技术的优势,已成为当前分子影像领域研究的热点和发展趋势。新近报道的七甲川菁(heptamethine cyanine)染料是一类具有肿瘤靶向性的近红外荧光(nearinfrared fluorescence,NIRF)制剂。该染料独特的光学特征使其在肿瘤分子影像、靶向治疗和药物传递系统方面具有广阔的应用前景。纳米材料包裹该类染料可用于NIRF/MRI双模成像,标记核素后可实现NIRF/PET双模成像,共轭结合化疗药物后,可实现抗肿瘤药物的靶向传递,多个七甲川菁染料的复合物已被用作多模态成像,成为光热、光动力学和组合治疗肿瘤的新策略。     

胃癌血管靶向肽GX1修饰的人血清白蛋白用于胃癌近红外活体成像

目的:以肿瘤血管靶向肽GX1修饰的人血清白蛋白(HSA)作为吲哚菁绿(ICG)的载体,合成近红外荧光探针GX1-HSA-ICG,研究其作为近红外荧光探针在荷人胃癌裸鼠活体中的靶向成像能力。方法:以HSA作为ICG的载体,通过化学修饰与GX1共价连接,合成GX1-HSA-ICG纳米颗粒探针;使用SDS-PAGE对探针合成进行鉴定;采用探针与脐静脉内皮细胞HUVEC以及与肿瘤细胞共培养的脐静脉内皮细胞Co-HUVEC进行结合和竞争抑制试验,验证探针和Co-HUVEC细胞结合的特异性;利用小动物活体成像系统对皮下荷胃癌小鼠进行近红外荧光活体成像,验证探针在体内的胃癌靶向性。结果:成功合成GX1-HSA-ICG。细胞结合与竞争抑制实验显示GX1-HSA-ICG可与Co-HUVEC细胞特异性结合;荷瘤小鼠活体成像也显示出GX1-HSA-ICG较ICG有更长体内的循环时间,并且胃癌组织局部较HSA-ICG有更强的聚集。结论:本研究成功合成了胃癌血管靶向肽GX1修饰的HSA为荧光染料载体的胃癌血管靶向探针,成功对荷胃癌裸鼠进行了活体成像。使用HSA为载体的探针较单纯使用ICG的肿瘤局部滞留能力显著提高,GX1增加了探针的胃癌靶向特异性。该探针在胃癌的早期诊断和抗肿瘤血管生成治疗评估中具有潜在的应用价值。     

活体荧光成像对裸鼠肝癌细胞系MHCC97-H原位移植模型的动态量化分析

目的:利用生物自发光的裸鼠肝癌原位移植模型,以活体荧光成像技术对肝癌的生长和转移情况进行动态、量化分析.方法:将稳定转染了荧光素酶(luciferase)基因的人肝癌细胞株MHCC97-H-LUC细胞,移植至裸鼠肝脏包膜下,每周利用活体荧光成像系统对裸鼠体内移植瘤的生长部位和范围进行成像,测量肿瘤细胞生物发光量,动态观察肝癌细胞在裸鼠体内的肿瘤数量、生长速度和转移情况.结果:建立可稳定表达荧光素酶的人肝癌细胞株MHCC97-H-LUC并用于进行生物自发光的裸鼠原位移植模型;利用活体荧光成像系统对裸鼠体内的移植瘤成像,见发光部位由肝脏向腹腔扩散,发光量随时间呈指数级增长;病理学观察证实肿瘤细胞长.结论:利用活体荧光成像技术的动态量化分析可灵敏、准确地监测裸鼠肝癌原位移植模型中肿瘤细胞的生长及转移情况,为肿瘤发生、生长、转移机制及对抗肿瘤生长和转移的体内研究提供了科学的量化手段.     

基于临床手术标本的胰腺癌原位移植模型建立及评价

目的建立基于临床肿瘤标本的胰腺癌原位移植模型,开展模型的评价研究。方法将临床新鲜的胰腺癌手术标本移植到裸鼠胰腺部位,建立原位异种移植模型(PDOX),通过活体成像技术和PET/CT对肿瘤生长状况进行评价;采用STR技术分析移植瘤的来源,通过组织形态观察和免疫组化判定移植瘤的病理学特征,同时检测PDOX模型外周血中CA19-9的表达水平。结果模型建立6周后,通过活体成像观察到近红外荧光信号明显富集在肿瘤部位,通过荧光强度可以初步判断肿瘤位置和大小;使用小动物PET/CT可清晰观察到腹部18F-FDG分子探针富集区域,与预期的肿瘤位置和大小一致;安死术后,解剖分离的各个脏器组织及肿瘤组织,通过近红外荧光成像进一步确认肿瘤生长状况;STR检测证实移植瘤人源性比率为99.99%;组织形态学和免疫组化分析表明移植肿瘤生长于裸鼠胰腺;血清中CA19-9检测进一步证实了胰腺癌的发生。结论成功建立了人胰腺癌原位异种移植模型,通过小动物活体成像、PET/CT等技术对模型进行了全面评估,为胰腺癌的发病机制和治疗研究提供了良好的动物模型。     

荧光素酶标记人胃癌细胞裸鼠原位移植模型的建立

目的建立荧光素酶标记人胃癌原位异种移植模型。方法将萤火虫荧光素酶作为标记基因导入人胃癌MGC803细胞,建立稳定表达荧光素酶的细胞,将其接种裸鼠胃壁浆膜下,建立胃癌裸鼠原位肿瘤模型。用活体荧光成像系统检测肿瘤的发生发展,并进行小动物超声影像和病理学分析。结果裸鼠原位成瘤率为100%,活体荧光成像观察发现在接种第7天,就可以观察到肿瘤发光。21 d后肿瘤进入对数生长期,28 d后肿瘤出现明显坏死,平均荧光光子数呈现下降趋势。超声成像发现小鼠胃部有直径为8.39 mm,面积为28.92 mm2瘤块。结论荧光素酶标记可以实时监测原位异种移植人胃癌生长状况。     

近红外荧光染料IR-783介导的肿瘤成像

目的评估近红外荧光染料IR-783在犬自发性肿瘤中的特异性成像。方法将IR-783染料(5μmol/kg)腹腔注射荷瘤裸鼠,通过活体成像仪检测IR-783的代谢周期,在此基础上,将IR-783染料(1.5μmol/kg)通过后肢静脉注射入自发肿瘤犬体内,5 d后手术切除肿瘤组织,分别进行荧光成像、组织切片HE染色、冰冻切片荧光观察。结果 IR-783染料注射荷瘤裸鼠后可以在肿瘤部位检测到特异性荧光,连续观察8 d,仍有较强的荧光。IR-783注射自发肿瘤犬5 d后,可在肿瘤组织中检测到特异性荧光。结论近红外荧光染料IR-783能够被肿瘤组织特异性吸收,可用于犬自发性肿瘤的特异性诊断,具有重要的临床应用前景。     

近红外荧光染料IR-783在膀胱癌中的成像研究

目的:观察研究近红外荧光染料IR-783在膀胱癌中的特异性成像。方法:通过染料与膀胱癌细胞及正常细胞共孵育,观察近红外荧光染料IR-783是否能够实现膀胱癌细胞的选择性成像。利用细胞器示踪剂观察近红外荧光染料在膀胱癌细胞内的共定位;使用IR-783检测循环血液中及尿液中的膀胱癌细胞。结果:近红外荧光染料IR-783可被膀胱癌细胞选择性摄取。IR-783可选择性聚集在膜性细胞器如线粒体和溶酶体内,这种选择性聚集作用使IR-783可以保持较长的染色效果。近红外染料可以检测到血液或尿液极少量的膀胱癌细胞。结论:近红外荧光染料IR-783能够被膀胱癌细胞特异性吸收,可用于血液和尿液中膀胱肿瘤细胞的特异性诊断,具有重要的临床应用前景。     

荧光素酶标的人肝癌细胞裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和PET-CT成像比较

目的利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞株BEL-7402建立裸鼠肝原位移植模型,及小鼠肝原位移植模型的生物发光和小动物PET-CT成像的比较。方法构建表达荧光素酶基因的真核表达载体并将其转入人肝癌细胞BEL-7402,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆并扩大培养。BALB/cA-nu裸鼠肝门静脉接种5×105个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像和小动物PET-CT成像系统观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达Luc的人肝癌细胞株,将其接种到裸鼠体内,活体荧光成像系统观察发现能够成瘤,小动物PET-CT影像观察发现小鼠肝脏边缘对18 F-FDG有高摄取区域。结论利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞BEL-7402成功建立了原位肝癌裸鼠模型,小动物活体成像结合小动物PET-CT技术为原位肿瘤模型的建立提供了一种新的可靠的技术,为进一步研究肝癌生长转移机制和药物开发提供了新的有用工具。     

利用萤光素酶标记的肿瘤细胞建立肝癌原位移植模型及其活体成像

目的：利用生物发光成像技术非侵入性地监测活体裸鼠原位肝癌发展过程。方法：将包含有萤火虫萤光素酶基因的pCI-neo-Luc载体转染人肝癌HepG2细胞系,筛选获得具有高萤光素酶活性的细胞克隆;利用流式细胞仪对萤光素酶表达的稳定性进行初步研究,并分析细胞的生物发光情况;持续表达萤光素酶的肿瘤细胞培养扩增后被植入裸鼠皮下,2周后以形成的异体瘤作为供体瘤,进行肝脏原位移植手术;对建立的肝癌原位移植模型,用影像学资料显示肿瘤部位,用IVIS成像系统动态监测肿瘤生长情况。结果：体外影像的结果显示,表达萤光素酶细胞的数量与发光强度呈正相关;活体成像的结果显示。成功地建立了萤光素酶标记的原位肝癌动物模型。结论：生物发光成像可以监测活体内肝癌演进过程,为抗肿瘤药物的筛选和评价提供了新的手段和工具。     

基于临床肿瘤标本的胃癌转移模型建立

目的建立基于临床肿瘤标本的胃癌转移模型,为胃癌的转移研究提供个体化动物模型。方法将胃癌新鲜的手术标本移植到裸鼠皮下,建立胃癌患者异种移植(patient-derived xenograft,PDX)模型。进一步通过手术将皮下瘤组织原位移植到裸鼠胃部肌层,连续观察裸鼠的体征状态,通过近红外荧光活体成像技术检测肿瘤转移的发生。解剖荷瘤小鼠,将肺部转移灶进一步移植裸鼠皮下获得实体瘤。HE染色观察原发瘤与转移瘤的结构特征,(short tandem repeat) STR分析原发瘤和转移瘤的遗传特性。PCR-Array分析转移瘤和原发瘤中转移相关基因的表达。结果成功建立胃癌PDX模型,移植瘤组织结构与患者保持基本一致;通过胃部原位移植发现编号C19751的小鼠发生肺和肝的转移。其中肺转移灶皮下移植后获得了实体瘤,STR分析显示原发瘤保持了与肺转移瘤一致的遗传特征。PCR-Array结果显示,与原发瘤相比,转移瘤中CXCL12,IGF1和MMP2基因表达均显著上调。结论利用临床肿瘤标本成功建立胃癌转移模型,为胃癌转移研究提供了良好的个体化模型。     

新型近红外荧光探针MHI85在胆道系统成像的实验研究

目的:观察一种新型近红外荧光探针MHI85在器官中的成像特点,寻找特异性的器官成像荧光探针,为手术提供帮助。方法:用海洋光学测量系统检测近红外荧光探针MHI85的吸光度和荧光强度,分析其光学特点。随后将近红外荧光探针MHI85注射到CD-1小鼠体内,4小时后观察小鼠体内腹腔、胆囊和胆管、离体小鼠腹部脏器的近红外荧光成像情况。并测量离体脏器的信号背景比(SBR)。结果:近红外荧光探针MHI85最大吸收峰值和荧光峰值分别在690 nm和713 nm,说明其发光谱在700 nm左右,且成像稳定。利用小动物活体成像系统发现,近红外荧光探针MHI85在小鼠胆囊、胆囊管、左右肝管、肝总管可见明显荧光信号。心、肺、肝、胰、脾、肾、十二指肠、小肠均无荧光信号,而胆囊中可见明显的荧光信号。离体脏器SBR结果显示,胆囊的SBR明显高于其他脏器。结论:近红外荧光分子探针MHI85对胆囊及胆道系统具有良好的靶向性,且成像清晰、定位准确。     

基于双荧光系统的HepG2肝细胞癌原位移植裸鼠模型建立及活体荧光成像动态定量分析

目的:建立一种可以实时、定量、动态监测的肝细胞癌原位移植模型,并利用活体荧光成像系统对裸鼠体内原位肝细胞癌生长进行分析。方法:利用慢病毒包装系统包装pCDH-GFP-Luc质粒,将绿色荧光蛋白(GFP)和萤光素酶(Luc)基因通过病毒感染的方式整合到HepG2肝癌细胞染色体中,利用流式细胞术分选GFP+细胞,扩增培养后,将该细胞注射到裸鼠皮下进行成瘤,成瘤后分离肿瘤组织接种裸鼠肝脏,将造模成功的裸鼠分为对照组和治疗组,分别灌胃给与0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和50 mg/kg索拉非尼,2/d,连续28 d,每7 d利用活体荧光成像系统观察肝癌细胞在对照组和治疗组裸鼠肝脏内的生长情况。实验结束后,分离裸鼠肝脏肿瘤,拍照称重。结果:建立了稳定表达双荧光的人肝癌细胞系HepG2-GFP-Luc,体外发光强度与表达萤光素酶的细胞数量呈正相关(R2=0.9945);建立了肝细胞癌原位移植活体荧光成像模型,对照组和治疗组肝脏内肿瘤细胞荧光强度随时间的延长逐渐增加,治疗组荧光强度明显低于对照组。定量分析结果显示,在第24、31和38 d,治疗组荧光总光子数值显著低于对照组;治疗组平均瘤重显著低于对照组。结论:建立了一种肝细胞癌原位移植荧光成像模型,可通过活体成像系统对肿瘤大小进行动态定量分析,为抗肝癌药物的药效学评价提供了实时定量分析动物模型。     

一体化的光声-荧光显微镜用于活体肿瘤成像

报道了一种利用单一波长激发的同时产生光声和荧光信号的显微成像系统,本成像系统具有超高的成像分辨率(<6μm)。借助外源的造影剂在近红外的吸收特性,利用光声-荧光显微成像系统对活体肿瘤进行光声/荧光成像。实验结果表明,光声-荧光显微镜在早期肿瘤的成像和检测等方面具有潜在的应用价值。因此,通过研究和选择适当的双模态造影剂,该系统在不同病理模型中可以提供更准确的组织信息及生理参数。     

有机荧光探针辅助的近红外荧光成像技术在宫颈癌中的应用

荧光成像已被广泛应用于生物医学和临床诊断领域。近红外(Near-infrared,NIR,700–1 700nm)荧光成像在NIR波段对生物组织显影,与可见光波段(400–760 nm)的传统荧光成像相比,更有助于提高成像的信噪比和灵敏度。高质量的荧光成像需要借助良好的荧光探针,纳米技术的快速发展使具备良好荧光特性的有机染料不断涌现。与无机荧光探针相比,有机荧光探针具有安全性高、生物相容性好、光学稳定性强等优点。因此有机荧光探针辅助的NIR荧光成像可为研究者提供生物样品的结构和动态信息,是当前光学、化学、生物医学等多学科交叉研究领域的热点。文中结合近年来有机荧光探针在宫颈癌成像应用中的研究,概述了几种典型的有机荧光探针辅助NIR荧光成像在宫颈癌中的应用,如吲哚青绿、七甲川菁染料、罗丹明类荧光探针和聚合物荧光纳米颗粒,并对其发展前景和应用价值进行了展望。     

荧光标记技术在肿瘤模型研究中的应用

目的利用绿色荧光小鼠和红色荧光蛋白标记肿瘤细胞,建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细胞水平直接观察肿瘤的技术。方法将小鼠B16黑色素瘤细胞接种到绿色荧光蛋白转基因小鼠皮下,建立GFP小鼠肿瘤模型。以红色荧光蛋白作为标记基因导入小鼠黑色素瘤细胞B16细胞,建立稳定表达红色荧光蛋白的细胞株。将表达红色荧光蛋白B16细胞接种到绿色荧光转基因小鼠皮下,建立双荧光小鼠肿瘤模型。用荧光显微镜和活体荧光成像系统检测小鼠肿瘤的发生发展。结果分别建立了GFP小鼠肿瘤模型和双色荧光小鼠肿瘤模型。利用活体荧光影像仪可以观察双色荧光小鼠模型中受体绿色荧光组织和红色荧光移植肿瘤相互融合。利用荧光显微镜,可以观察到肿瘤内绿色荧光标记的来源于受体小鼠的血管和免疫细胞。经香菇多糖刺激的GFP小鼠肿瘤模型的移植瘤组织中,来源于受体小鼠绿色荧光标记的免疫细胞明显多于经生理盐水刺激的对照小鼠。结论利用绿色荧光小鼠和红色荧光RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互作用。     

三株荧光素酶标记的小鼠乳腺癌细胞在小鼠体内生长及转移的比较

目的采用活体成像技术比较三株荧光素酶标记的小鼠乳腺癌细胞在小鼠体内生长及转移情况,为研究肿瘤转移提供理想的动物模型以及活体分析方法。方法以荧光素酶（luciferase,Luc）作为报告基因导入小鼠乳腺癌细胞4T1、66c14和4TO7中,经G418筛选获得稳定表达荧光素酶的细胞克隆并扩大培养。标记细胞稀释成1×107cells/mL,取0.1 mL进行乳腺原位及尾静脉接种BALB/c小鼠,制作小鼠乳腺原位和尾静脉移植瘤模型,比较三株细胞在小鼠体内生长及转移情况。结果获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆,将Luc标记的4T1、66c14、4TO7细胞对BALB/c小鼠乳腺原位接种后7 d,均有肿瘤生长,接种后28 d,4T1细胞乳腺原位移植瘤最大,66c14细胞瘤体次之,4TO7细胞瘤体最小;接种后35 d,三株细胞乳腺原位移植瘤大小较一致,但4T1和66c14原位移植瘤均发生转移,其中4T1细胞较66c14细胞转移严重,而4TO7细胞未见转移;接种后42 d,三株细胞乳腺原位移植瘤大小无明显差别,而4T1和66c14细胞随天数的增加,移植瘤转移程度逐渐严重,4T1较66c14细胞转移更严重,呈广泛性转移,4TO7细胞仍未见转移。将Luc标记的4T1、66c14、4TO7细胞对BALB/c小鼠尾静脉接种后7 d,小动物活体成像发现小鼠肺部均能检测到荧光,其中4T1细胞接种的小鼠肺部荧光信号最强,且小鼠陆续死亡;4TO7细胞接种小鼠肺部荧光信号次之;66c14细胞接种小鼠肺部荧光信号最弱。尾静脉接种后14 d,4TO7和66c14细胞随着观察天数的增加,转移程度逐渐严重,4TO7细胞接种小鼠肺部荧光信号较66c14细胞强且小鼠陆续死亡。结论乳腺原位自发转移模型较尾静脉转移模型更真实反应了肿瘤细胞在体的转移特性,且能完整地呈现肿瘤转移的全过程,可作为研究肿瘤转移的最理想模型。