抗人肝癌单抗片段抗体HAb18F(ab′)2的冻干工艺研究

选择适合于HAb18 F(ab′)2片段抗体的冻干保护剂及其冻干工艺,是确保该生物制品的质量关键之一,对不同种类和不同浓度的保护剂进行了研究,结果表明10%蔗糖对HAb18 F(ab′)2片段抗体冻干样品的剂型、外观、残水量(＜3%)、复溶时间(＜10 s)、纯度(＞95%)及稳定性没有影响.研究优化与保护剂相结合的适用于HAb18 F(ab′)2片段抗体的最佳冻干工艺,为抗体片段扩大生产提供依据.     

抗人肝癌单抗片段抗体HAb18F(ab'''')_2的冻干工艺研究

选择适合于HAb18F(ab')2片段抗体的冻干保护剂及其冻干工艺,是确保该生物制品的质量关键之一,对不同种类和不同浓度的保护剂进行了研究,结果表明10%蔗糖对HAb18F(ab')2片段抗体冻干样品的剂型、外观、残水量(<3%)、复溶时间(<10s)、纯度(>95%)及稳定性没有影响。研究优化与保护剂相结合的适用于HAb18F(ab')2片段抗体的最佳冻干工艺,为抗体片段扩大生产提供依据。     

新型精制抗蛇毒血清的制备

目的对传统抗蛇毒血清精制方法进行改进,研制出一种高收率、高纯度、低成本、易于保存与使用的新型抗蛇毒血清的制备方法。方法先提取抗蛇毒血清的IgG后酶解分段盐析得F(ab′)2片段,通过疏水层析进一步纯化F(ab′)2,然后脱盐冻干。结果新方法制备的蛇毒F(ab′)2纯度达90%以上,收率60%以上。结论采用新方法制备的F(ab′)2纯度和收率有很大提高,在其它试剂不增加的情况下,降低了一半的硫酸铵用量,生产周期由原来72h缩短到48h。     

抗金环蛇毒血清生产工艺的研究

目的研制抗金环蛇毒血清,以解决被金环蛇咬伤后的救治问题。方法以金环蛇毒为免疫原免疫马获得免疫血浆,经盐析制备IgG,IgG再经酶解、疏水柱纯化后得到F(ab′)2活性片段,并以免疫扩散、ELISA测定其抗体特异性,以小鼠试验法测定其中和金环蛇毒能力。结果得到的抗血清F(ab′)2冻干品纯度达90%以上。结论研制出了特异性强、效价高的抗金环蛇毒血清。     

CD20F(ab′)2抗体的发酵与纯化

转化了质粒PYZcpp3的 16C9大肠杆菌可高水平地分泌表达可溶性CD2 0F(ab′) 2 抗体 ;采用经优化的培养条件 ,在发酵罐上进行高密度培养OD550 值达 14 0 ;每升湿菌菌重 2 0 0g ;抗体的产量每升为 2 4 1mg ,其中F(ab′) 2 片段达 5 0 % ,F(ab′) 2 可以特异性的识别CD2 0 细胞并与CD2 0相结合 ;F(ab′) 2 对Raji细胞的IC50 值为 2 2 8μg mL ;而Fab′对Raji细胞的IC50 值为 4 5 9μg mL。     

抗CD20嵌合抗体片段F(ab′)2突变体在大肠杆菌中的高效分泌表达

构建抗CD20嵌合抗体片段F(ab′)₂ 突变体 ,研究其在大肠杆菌中的高效表达及其表达产物的生物学活性。采用PCR法构建抗CD20嵌合抗体片段F(ab′)₂ 突变体 ,并用双脱氧终止法测定DNA序列 ;采用 19L发酵罐高密度发酵抗CD20嵌合抗体片段F(ab′)₂ 突变体 ,采用亲和色谱和分子筛色谱法纯化表达产物 ,并用SDS-PAGE和薄层激光扫描鉴定纯化产物 ;采用活细胞间接免疫荧光法测定纯化产物与靶细胞的结合活性 ;MTT法测定纯化产物对Raji细胞的生长抑制作用 ,并研究其作用机理。DNA序列测定结果表明 ,抗CD20嵌合抗体片段F(ab′)₂ 突变体已成功构建 ,表达可溶性产物的产量达 360mg L ,具有与Raji细胞 (CD20⁺)结合的活性 ,并抑制Raji细胞的生长 ,其作用机理为诱导Raji细胞凋亡。此突变体有望成为治疗非何杰金氏B细胞淋巴瘤的药物。     

保加利亚乳杆菌冻干保护剂的优化

目的 研究4种常用冻干保护剂的添加量.方法 以保加利亚乳杆菌为出发菌株,以其冻干菌粉活菌数为指标,通过正交试验优化4种常用冻干保护剂的添加量.结果 保加利亚乳杆菌的最佳冻干保护剂配比为乳糖∶谷氨酸钠∶抗坏血酸∶脱脂奶粉=3∶1∶2∶7,其中脱脂奶粉对菌体保护效果极显著(P＜0.01),乳糖对菌体保护效果显著(P＜0.05).结论 通过对保加利亚乳杆菌的4种常用冻干保护剂的添加量进行优化,为保加利亚乳杆菌的冻干工艺提供基础.     

仔猪副伤寒活疫苗中耐热保护剂应用相关参数的研究

【目的】研究并确定耐热保护剂在仔猪副伤寒活疫苗中应用的各参数,为制备细菌耐热保护剂活疫苗提供参考。【方法】将耐热保护剂与制苗菌液等体积混合,分别采用3种常用冻干曲线(1、2、3)进行冻干,抽样检测确定耐热保护剂配套冻干曲线。在确定合适冻干曲线的基础上,进一步研究耐热保护剂与不同菌龄菌液(发酵培养12、15、18和21 h)、不同浓度菌液(菌液终浓度分别为3×1010、5×1010和7×1010 CFU/m L)、不同感作时间(分别作用0、24和48 h)、耐热保护剂的不同保存时间(2-8°C分别保存0、10、20、30和40 d),以及不同分装量(2、3和4 m L)等多种不同参数对疫苗质量的影响。【结果】配套冻干曲线研究表明,曲线2冻干的产品性状、活菌存活率与耐老化指标效果最好;菌龄研究表明,37°C发酵培养18 h(位于对数生长末期或稳定前期),其冻干菌存活率达78%-81%,优于其它时间;配苗试验表明,菌液适宜终浓度为3×1010-5×1010 CFU/m L;最适感作时间为2-8°C感作24 h,冻干菌存活率可达85.3%-90.5%;耐热保护剂保存期试验表明,2-8°C保存40 d与0 d(配制当日)的保护剂冻干效果基本一致;配苗分装量试验表明,7 m L西林瓶中分装3 m L或4 m L,其冻干菌存活率与2 m L基本一致,但耐老化试验中活菌存活率比2 m L略高。【结论】收获发酵培养18 h的菌液、配苗终浓度采用3×1010-5×1010 CFU/m L,使用2-8°C保存40 d内的耐热保护剂,让保护剂与制苗用菌液2-8°C感作24 h,采用3-4 m L进行定量分装,按曲线2冻干为制备仔猪副伤寒耐热保护剂活疫苗的适合参数。     

介绍一种广泛用于免疫化学的新试剂——Protein A

Protein A是存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁上的蛋白质,它与细胞壁共价结合。这种蛋白质与免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)有高亲和力的特性,利用这一特性可以分离来自人类的G1、G2、G4、A2和各种动物的Ig,如兔、绵羊、山羊、大鼠、针鼹的IgG,小鼠的G2a、G3,猪的G1、G2等。如果用Protein A固相柱,也可有效地分离Ig的F(ab)、F(ab′)_2,以及将F(ab)、F(ab′)_2与Fc分开。可见     

CD20F(ab')2抗体的发酵与纯化

转化了质粒PYZcpp^3的16C9大肠杆菌可高水平地分泌表达可溶性CD20 F(ab’)2抗体;采用经优化的培养条件,在发酵罐上进行高密度培养OD550值达140;每升湿菌菌重200g;抗体的产量每升为241mg,其中F(ab’)2片段达50％,F(ab‘)2可以特异性的识别CD20^ 细胞并与CD20相结合;F(ab‘)2对Raji细胞的IC50值为22.8μg／mL;而Fab’对Raji细胞的IC50值为45．9μg／mL。     

马血清破伤风抗毒素与马破伤风免疫球蛋白F(ab′)_2过敏反应比较

目的比较马血清破伤风抗毒素(TAT)与马破伤风免疫球蛋白F(ab′)2的过敏反应情况。方法将400例开放性外伤患者根据投硬币法随机分为TAT组和马破伤风免疫球蛋白F(ab′)2组(简称马破组)。TAT组190例,皮试阴性者128例,阳性者57例,强阳性5例。马破组210例,皮试阴性者182例,阳性者27例,强阳性1例。结果 TAT组皮试阳性率30%,皮试阳性者过敏率43.86%,皮试阴性者过敏率3.91%,总过敏率16.22%。马破组皮试阳性率12.86%,皮试阳性者过敏率7.41%,皮试阴性者无过敏病例,总过敏率0.96%。两组皮试阴性者发生过敏反应比较,P=0.0130.05;两组皮试阳性者发生过敏反应比较,χ2=6.477,P=0.0110.05,差异有统计学意义。两组总过敏率比较,χ2=25.927,P=0.0000.01,有显著统计学意义。结论注射TAT者过敏反应较多,注射马破伤风免疫球蛋白F(ab′)2者过敏反应极少。用马破伤风免疫球蛋白F(ab′)2替代TAT,能减少过敏反应的发生,降低安全隐患。     

大肠杆菌F18菌毛及其亚型的PCR鉴定

F18菌毛是产肠毒素大肠杆菌 (ETEC)与产vero细胞毒素大肠杆菌 (VTEC)的重要致病因子 ,可介导细菌对小肠细胞的黏附 ,并具有F18ab和F18ac 2个抗原亚型。根据已发表的F18ab菌毛A亚单位 (FedA ab)的基因 (fedA ab)设计 3条引物 ,建立了 2种聚合酶链式反应 (PCR)扩增方法。通过对F18ab 大肠杆菌、F18ac 大肠杆菌、K88 大肠杆菌、K99 大肠杆菌、987P 大肠杆菌、F4 1 大肠杆菌的试验 ,结果表明所建立的PCR方法可特异性鉴定F18 大肠杆菌并区别其亚型F18ab与F18ac     

马破伤风免疫球蛋白F(ab′)_2皮试判断标准及脱敏注射法的探讨

目的探讨马破伤风免疫球蛋白F(ab′)2皮试结果判断标准和注射方法。方法将300例急诊外伤患者随机分为传统组(n=140)和改进组(n=160),分别用不同的判断标准和注射方法进行对照研究。结果传统组阳性91例(65%),改进组7例(4.38%),两组间比较差异具有显著统计学意义(P0.01);两组脱敏后传统组出现14例过敏反应,改进组出现1例过敏反应。结论改进后的马破伤风免疫球蛋白F(ab′)2皮试的判断标准和脱敏注射方法较传统方法阳性率大幅度降低,阳性者中过敏反应极低,而且该法省时、安全、有效、患者痛苦小。     

低pH孵放法对马破伤风免疫球蛋白F(ab′)_2病毒灭活效果的验证

目的采用低pH孵放法对马破伤风免疫球蛋白F(ab′)_2样品中辛德毕斯病毒(sindbis virus, SINV)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)、脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus, EMCV)的灭活效果进行验证。方法以SINV、VSV、EMCV作为指示病毒,将3批马破伤风免疫球蛋白F(ab′)_2的pH调至4.1±0.1,每批12瓶(3 mL/瓶),分别加入333μL指示病毒,25℃放置21 d灭活病毒,同时设置中性对照和阳性对照,并于0 d、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d取样测定剩余病毒滴度,验证低pH孵放法的病毒灭活效果。结果马破伤风免疫球蛋白F(ab′)_2样品经低pH孵放处理21 d后,SINV、VSV和EMCV等3种指示病毒残余病毒滴度均≤0.5 lgTCID_(50)/0.1 mL,灭活效果分别达到5.50～5.83、5.70～6.00和6.00～6.17 lgTCID_(50)/0.1 mL。结论采用低pH孵放法处理马破伤风免疫球蛋白F(ab′)_2中SINV、VSV、EMCV,病毒滴度下降值均>4 lgTCID_(50)/0.1 mL,灭活效果较好。     

片段抗体纯化工艺的优化

以单克隆抗体为特异性载体标记放射性核素用于肿瘤病人的导向治疗 ,已取得很好的效果。用蛋白酶水解全抗体得到的Ｆ(ａｂ′) 2 片段 ,由于去除了Ｆｃ段 ,减小了人抗鼠异种蛋白排斥反应 ,具有分子量小 ,到达肿瘤部位迅速 ,血液本底和非瘤组织的清除快等优点 ,较之全抗体有更大应用潜力。但Ｆ(ａｂ′) 2片段性质不稳定 ,制备工艺复杂 ,采用旧的纯化工艺如分子筛、离子交换、亲和色谱[1～ 3] 等很难制备出符合临床应用质量标准的片段抗体。为此 ,我们在ＦＰＬＣ上建立了疏水作用色谱法纯化Ｆ(ａｂ′) 2 片段 ,取得了理想的结果。本文报道三组不…     

阪崎肠杆菌标准品制备中冻干工艺的优化

本研究对阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)冻干工艺进行优化,旨在为E.sakazaki定性标准品和定量标准品的制备提供技术基础,同时为其他肠杆菌科标准品的制备工艺提供理论指导.实验结果表明:最佳冻干保护剂组合为海藻糖3%,脱脂奶粉8%,谷氨酸钠1.5%;最佳预冻温度和预冻时间分别为-20℃,4 ...     

无血清培养HAb18细胞的生长代谢与抗体分泌特征

通过逐步降低血清浓度,HPLC氨基酸分析及正交实验筛选研制了HAb18杂交瘤细胞的无血清培养基。对在该无血清培养条件下的细胞进行了计数,对培养上清液进行了葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸和氨浓度以及抗体分泌量和抗原结合活性测定,并对动力学参数进行了分析,结果表明HAb18细胞在无血清培养条件下达到的最大细胞密度和抗体分泌量分别为0.91×106个/ml和43.8mg/L;细胞比生长速率较在有血清条件下稍有下降,而抗体合成速率提高(0.0207/h比0.0218/h,0.387pg/cell/h比0.218pg/cell/h,P<0.01)。无血清培养时葡萄糖和谷氨酰胺消耗无明显变化,但乳酸浓度降低,氨浓度升高;此外,分泌抗体的抗原结合活性增加。研究无血清培养条件下的HAb18细胞生长代谢和抗体分泌特征可为建立HAb18无血清悬浮流加培养工艺打下基础。     

水痘疫苗新型疫苗冻干保护剂的研究

目的:开发出新型号水痘疫苗保护剂替代现行含明胶、人血白蛋白疫苗保护剂,提高病毒保护效果及疫苗受种人群使用安全性。方法:(1)选取右旋糖酐、乳糖、甘露醇等辅料按不同配方进行制备疫苗保护剂。(2)使用不同配方制备的疫苗保护剂,应用细胞工厂水痘疫苗制备工艺进行生产水痘疫苗。(3)使用不同配方制备的疫苗保护剂生产的水痘疫苗与现行疫苗保护剂生产的水痘疫苗进行对比。结果:对比试验结果显示,使用右旋糖酐、乳糖、甘露醇等制备的疫苗保护剂,与现行疫苗保护剂比较无差异。结论:使用右旋糖酐、乳糖、甘露醇等制备的疫苗保护剂比较现行使用的疫苗保护剂,由于不含明胶及人血白蛋白,因此使该疫苗冻干保护剂的安全性、可靠性有所提高,并且疫苗冻干保护剂的成本将有所下降。     

应用F(ab')_2~-酶联吸附分析法检测大麦黄花叶病毒

F(ab′)_2酶联免疫吸附分析法(F(ab′)_2-ELISA)成功地用于大麦黄花叶病毒(BaYMV)的常规检测和诊断.其步骤是先用稀释1000—4000倍的抗血清F(ab′)_2包被反应板,加待测样品和稀释1000倍的同种抗血清或IgG,然后再加A蛋白碱性磷酸酯酶和底物,测定OD值。比较试验表明,ELISA稀释缓冲液加入1％小牛血清或1％全脂奶粉,BaYMV的测检灵敏度可提高达2.5—5.0ng/ml,病叶汁液检测终浓度为稀释1600—3200倍。我国BaYMV分离物与英国分离物的血清学性质完全一致。BaYMV在大麦病株中以叶部含量较高,茎中含量次之,根部测不出病毒。检测和诊断田间样品,即使有的样品已不新鲜,也均能得到满意的结果。此方法也成功地用于大麦温和花叶病毒(BaMMV)、小麦黄花叶病毒(WYMV)、燕麦花叶病毒(OMV)和燕麦金色条纹病毒(OGSV)等禾谷多粘菌传麦毒的检测,这S种病毒的血清学关系研究表明,除BaYMV和WYMV之间具有血清学关系以外,其余彼此均不反应。     

保护剂对混合甲烷氧化菌剂中菌群结构的影响

[目的]明晰混合甲烷氧化菌剂制备工艺及保护剂对菌群结构的影响。[方法]通过正交实验优化保护剂配方,并结合高通量测序分析菌剂制备前后菌群结构及甲烷降解能力变化。[结果]当保护剂配比为葡萄糖浓度(单位为g/mL菌液) 2. 5%、甘油15%、脱脂乳粉10%时,菌群存活率高达112. 7%;菌群结构由冻干前的优势菌Methylocystaceae(甲基孢囊菌属)、Acidovorax(食酸菌属)等演替为Ralstonia(罗尔斯顿菌属)、Stenotrophomonas(寡养单胞菌)等,其中对甲烷降解作用的Methylocystaceae(甲基孢囊菌属)冻前丰度71. 70%降为冻后的4. 26%;甲烷降解率由冻前的76. 21%降为冻后的74. 23%。[结论]混合菌剂制备过程中保护剂作为新碳源及能源影响了菌群结构,甲烷降解率下降2. 6%。菌群对外界因素的响应灵敏,但群体行为之间的关系和机理还有待探析。