聚乙二醇修饰超氧化物歧化酶的初步研究

目的:对玉米超氧化物歧化酶(SOD)进行共价修饰,以提高其稳定性.方法:以分子量为6000Da的活化聚乙二醇(PEG)为修饰剂,对玉米超氧化物歧化酶(SOD)进行共价修饰,并确定最佳反应条件.将天然SOD与PEG-SOD分别进行热稳定性、酸碱稳定性及抗蛋白酶稳定性的比较实验.结果:在最佳反应时间10h、最佳反应温度4℃时PEG与SOD反应获得的PEG-SOD比天然SOD在热、酸、碱及抗酶解三方面的稳定性均有不同程度的提高.结论:玉米超氧化物歧化酶经PEG修饰后稳定性显著提高.     

重组人超氧化物歧化酶化学修饰的初步研究

在高效表达重组人铜锌超氧化物歧化酶(rh Cu/Zn SOD),并纯化得到比活大于4000单位的 rh Cu/Zn SOD 纯品的基础上,采用活化酯法将聚乙二醇(PEG)与 rhCu/Zn SOD 交联,获得分子量约6万的 PEG-SOD 交联物.经 PEG 修饰的酶稳定性增强,表现为对酸、碱和热的耐受力均较未交联酶高.修饰酶的生物半衰期为15h,是天然酶的90倍,酶活性保留80%以上.还实验观察了修饰剂用量与修饰酶保留活性之间的关系.     

聚乙二醇修饰超氧化物歧化酶稳定性变化的研究

目的：了解各种分子量的聚乙二醇修饰超氧化物歧化酶(SOD)对其稳定的影响。方法：采用氰尿酰氯的修饰方法,用分子量为2000～20000的聚乙二醇(PEG)修饰SOD,测定SOD的酶活残存率及对修饰后的SOD的耐热、耐酸、耐碱和抗酶解能力进行研究。结果：聚乙二醇修饰后的SOD的耐热性、耐酸、耐碱以及抗酶解能力都明显增强,其中发现分子量6000的PEG修饰的SOD活件残余率较高,对酸、碱和酶的抗性较强。结论：分子量为6000PEG修饰的SOD的稳定性较高。     

月桂酸修饰超氧化物歧化酶的制备及其性质研究

用月桂酸对超氧化物歧化酶进行化学修饰以改善其稳定性.活化的月桂酸与SOD在40℃碱性条件下反应1h,再用Sephacryl S-200柱进一步纯化.修饰SOD活性回收率93%,比活为6000U / mg.具有较强的稳定性,基本上消除了免疫原性并明显地延长了在血液中的半衰期;该产品适用于化妆品和食品.     

牛血清白蛋白对超氧化物歧化酶的化学修饰

目的：通过化学修饰提高超氧化歧化酶（SOD）的稳定性,考察金属离子在不同浓度下对SOD活性的影响。方法：用戊二醛作为交联剂,用牛血清白蛋白（BSA）将牛红细胞超氧化物歧化酶进行化学修饰,得到SOD的修饰酶。对比研究三种SOD：修饰酶,混合酶及天然酶的理化性质。结果：修饰酶等电点降低,对温度、pH的稳定性较天然酶有很大提高,对胰蛋白酶和胃蛋白酶也表现出很强的耐水解性。二价离子Mg^2 、Mn^2 对天种SOD活力均有不同程度的抵制作用,Ca^2 、Zn^2 、Cu^2 对修饰酶活力有激活作用,一价离子K^ 对三种OSD活力均无明显影响.结论:修饰酶较天然酶的稳定性有很大的提高,加入Ca^2 、Zn^2 、Cu^2 可提高修饰酶的活力。     

溶液介电常数对铜锌超氧化物歧化酶活性的影响

溶液介电常数对天然酶和修饰酶的活性影响不同,天然酶随介电常数增加而酶活性下降,修饰酶则反之,这表明静电相互作用在铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD)与超氧阴离子(-O_2~(·-))反应过程中起着重要作用,酶分子活性中心附近ε-NH_3~+为O_2~(·-)进入活性中心提供静电吸引力。在有机溶剂中,SOD的构象会发生变化,从而导致酶活性降低。实验还表明,Cl~-对SOD有明显的抑制作用。     

磷脂化修饰影响超氧化物歧化酶细胞亲和力的研究

目的:研究磷脂化修饰对重组人超氧化物歧化酶(SOD)进入人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)、人心肌细胞(HCM)能力的影响。方法:分别运用流式细胞术和蛋白印迹分析磷脂化修饰的超氧化物歧化酶(PC-SOD)和SOD与HCAEC、HCM的结合能力,并用激光共聚焦显微术分析修饰前后的SOD可显著增强PC-SOD与细胞的亲和力,并可显著增强PC-SOD进入人冠状动脉内皮细胞和人心肌细胞的能力。     

毛细管电泳测定牛红细胞超氧化物歧化酶的巯基位点

本文介绍了毛细管电泳分析蛋白质酶解产物中含巯基多肽的方法。还原的及天然的牛红细胞超氧化物歧化酶(SOD)经4-乙烯吡啶修饰后,由TPCK-胰蛋白酶水解,在254nm检测到还原的SOD水解物中含3个巯基多肽,天然的SOD为1个疏基多肽且其毛细管电泳行为与上述3个多肽之一相一致。分析它们的氨基酸顺序,证实Cys-6为游离的巯基,Cys-55和Cys~(-144)形成二硫键。     

超氧化物歧化酶化学修饰的初步研究

本文以三聚氰氯为活化剂,采用聚乙二醇法对超氧化物歧化酶进行化学修饰,得到了均一的聚乙二醇-SOD加合物。修饰酶活力为天然酶的75％,表明酶活性中心结构基本保持。 对修饰酶残留氨基的测定表明,近80％可滴定氨基参加了反应,且SOD骨架结构在修饰前后变化不大,可以推测聚乙二醇是连结在蛋白质表面上的。     

硬脂酸修饰超氧化物歧化酶的制备及其性质研究

报道了一种修饰ＳＯＤ的方法。所得硬脂酸修饰ＳＯＤ比活力为每毫克蛋白１００００单位,经鉴定已达均一程度。测得其分子量为３５０００．修饰ＳＯＤ和天然ＳＯＤ在紫外光区的最大吸收均在２６５ｎｍ。修饰ＳＯＤ对温度、ｐＨ、蛋白酶水解的稳定性比天然ＳＯＤ增强,且免疫原性消除。在低浓度的某些有机介质中活性比在水中高。     

鸦肝超氧化物歧化酶的纯化

本文用低浓度氯化钠与肝脏一起匀浆,75℃加热,硫酸铵分级沉淀,在Cu~(2+)存在下透析,sephadex G-75柱层析等方法,从寒鸦肝脏中纯化出铜锌超氧化物歧化酶。对其理化性质鉴定表明,用此法纯化的SOD为均一性纯酶,比活性为4734U/mg pr,分子量32.6kD,紫外吸收峰在258.6nm。理化性质与文献报道的不同来源的同类酶基本相同。     

菠菜铁型超氧化物歧化酶的纯化及性质

用聚丙烯胺梯度凝胶电泳法检测出菠菜ＳＯＤ同工酶谱带中含３条Ｆｅ－ＳＯＤ活性带,菠菜叶Ｆｅ－ＳＯＤ粗提取液经硫酸铵分部沉淀,ＤＥＡＥ－纤维素－Ａ５２和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱层析,纯化出单一的Ｆｅ－ＳＯＤ活性带,纯化酶的分子量为４２．６ｋＤ,亚基分子量为２１ｋＤ。对金属元素的分析表明,该酶每分子含２．６个Ｆｅ原子,该酶紫外区最大吸收峰为２７８ｎｍ,等电点为４．６,氨基酸组成和其它来源的Ｆｅ－ＳＯ     

朱桔Mn-SOD的纯化、鉴定及浓度梯度胶电泳在其中的应用

朱桔叶中存在Mn-SOD、Fe-SOD和CuZn-SOD三种类型,在10%的PAGE中有三条活性带,其中Mn-SOD的Rf值大于Fe-SOD与CuZn-SOD₁的Rf值相同;在4%~35%的梯度胶电泳中有四条活性带,而Mn-SOD的R_f值最小,表明该酶带有较高的电荷密度。Mn-SOD占总活性的20%左右,已被纯化到均一程度。该酶的比活性为1 249 U/mg,分子量和亚基分子量分别为54.0 kD和26.6 kD,在紫外区最大吸收值为280 nm,在95℃处理15 min仍保留了46%的酶活性,等电点为5.06。该酶的活性不被KCN、H₂O₂抑制,但对1% SDS和氯仿-乙醇液敏感。     

Heat- shock Induced Protein in Pea Leaves Which is Immunoreactive to Gro EL Antibody

A high molecular weight protein was found in pea ( Pisum sativum L. ) seedling by means of Westem-blotting, and it consisted of a ct (60.4 kD) and α β (65.5 kD) subunits. The protein had low ATPase activity. Its expression could be enhanced by 3 to 4 folds under heat-shock stress, but was not affected by exogenous ABA. The results of localization and 35S-Met labeling showed that it was a cytoplasmic protein and its synthesis was not inhibited by chloramphenicol.     

Purification of Two Superoxide Dismutase Isozymes and Their Subcellular Localization in Needles and Roots of Norway Spruce (Picea abies L.) Trees

Two isozymes of superoxide dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) were purified from Norway spruce (Picea abies L.) needles to apparent electrophoretic homogeneity. Purification factors were 354 for SOD I and 265 for SOD II. The native molecular mass of both purified enzymes was approximately 33 kD, as determined by gel filtration. The subunit molecular weights, as estimated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, were 20,000 for SOD I and 16,000 for SOD II in the presence of 2-mercaptoethanol, and 15,800 and 15,000, respectively, in its absence. These results indicate that the native enzymes were homodimers whose subunits contained intrachain disulfide bonds. Isoelectric points determined by nondenaturing isoelectric focusing were 4.5 and 5.5 for SOD I and II, respectively. NH₂-terminal sequence analysis of the first 22 to 23 amino acids revealed 70 to 75% sequence identity with chloroplastic CuZn SODs from other plant species for SOD I, and 75% sequence identity with the cytosolic CuZn SOD from Scots pine for SOD II. SOD I was the major activity in needles and it was associated with chloroplasts. SOD II activity was dominant in roots.     

橄榄超氧化物歧化酶的分离纯化与性质研究

采用超声波破碎、硫酸铵分级沉淀、SephadexG-100和DE-52柱层析,从橄榄中分离纯化Cu,Zn-SOD,并对其部分性质进行分析鉴定。结果得到酶的比活力为906.3U/mg。该酶对H2O2和KCN敏感,而T氏液对酶活性没影响。紫外吸收峰在275nm处,PAGE蛋白和活性染色呈现3条相对应的谱带,相对分子质量约为31.63kD,亚基相对分子质量约为15.73kD。此酶对热稳定,在pH7~9范围内稳定。     

眼镜蛇毒中一个新的抗补体蛋白的分离纯化和性质研究

免疫性疾病、急性肺损伤、缺血再灌注损伤等病征的发生与补体异常激活密切相关。抗补体药物研究是新药开发的热点之一。本研究旨在从中华眼镜蛇毒中发现并分离纯化获得新的抗补体活性蛋白质,并对其理化性质和生物学活性加以研究。在抗补体活性追踪的指导下,采用蛋白质层析技术对眼镜蛇毒进行分离纯化;利用MALDI-TOF-MS、SDS-PAGE和葡聚糖凝胶过滤法测定目标蛋白质的纯度及分子量;等电聚焦凝胶电泳法测定其等电点;采用Edman降解法测定目标蛋白质的N-端氨基酸序列;测定目标蛋白质对补体经典途径和旁路途径的抑制活性以及可能的机制;采用MTT法和SRB法检测目标蛋白质对肿瘤细胞的杀伤作用;测定目标蛋白质对多种来源红细胞的溶血活性;采用KB平板扩散法检测抗菌活性。结果表明,通过SP Sephadex C-25阳离子交换层析和RP-HPLC C18反相层析,从中华眼镜蛇毒中分离纯化获得一个均一的抗补体蛋白质,将其命名为CTX-CI。还原性SDS-PAGE测得CTX-CI的表观分子量为12.7 kD,凝胶过滤法测得分子量为9.7 kD,MALDI-TOF-MS测得精确分子质量为7.0 kD;变性条件下测得CTX-CI的等电点为9-81;N-端氨基酸序列为LKCH。相关活性测定结果表明,CTX-CI能有效抑制人血清补体经典途径,其IC50为0.046 g/L,但对补体旁路途径无明显抑制作用;机制研究表明,CTX-CI能抑制补体经典途径C3转化酶的形成。同时,CTX-CI对肿瘤细胞株A549、K562和MCF-7细胞表现出抑制作用,其IC50分别为0.32 g/L、0.58 g/L、0.63 g/L;对豚鼠红细胞有轻微的溶血作用;能抑制枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的生长。综上所述,本研究从中华眼镜蛇毒中分离纯化出一个新的抗补体蛋白质CTX-CI,其理化性质和生物学活性表明其属于细胞毒素,CTX-CI能明显抑制补体经典途径,其机制与抑制经典途径C3转化酶的形成有关。     

放射损伤、烧伤与放烧复合伤血清成份对心肌细胞钙离子通道活动的影响

本实验研究了放射损伤、烧伤与放烧复合伤后血清成份对培养心肌细胞Ｌ－型钙离子通道活动的影响,结果表明：伤后血清对上述通道均有激活作用,从而改变细胞内钙离子水平,此可能为伤后心脏功能抑制的一个重要机理。在作用强度上,复合伤血清重于单一伤、烧伤重于放射损伤,这是导致不同伤后血清对心功能抑制程度不一的重要因素。对伤后血清成分作用的进一步研究表明：伤后血清大分子的作用不明显,主要是血清低分子与血清脂质起作用。其中,放烧复合伤血清低分子不仅使通道开放增加,还使膜片噪声增加,提示其作用包括改变其Ｌ－型钙离子通道活动与改变膜的物理特性二个方面,它们共同导致细胞的功能变化;血清脂质对钙通道的作用可被ＳＯＤ所抑制,表明其作用与氧自由基反应有关。至于伤后血清低分子与血清脂质中的具体毒性成分以及它们对Ｌ－型钙离子通道影响的调控机制,有待于进一步研究