花粉管通道法介导PRSV-CP基因dsRNA转化番木瓜

以番木瓜‘蔬罗Ⅰ号’植株为受体材料,采用花粉管通道技术将番木瓜环斑病毒外壳蛋白(PRSV-CP)基因3′-端同源序列dsRNA转入番木瓜子房中。用PCR方法对T0代种子进行了分子检测,获得53株转基因番木瓜,转化率达到8.9%;对获得的T0代转基因番木瓜进行了田间抗病性鉴定,结果表明,转基因番木瓜植株对番木瓜环斑病毒(PRSV)表现为不同程度的抗性,可以推迟发病。     

转基因番木瓜研究进展

番木瓜环斑病毒 (PRSV)使热带亚热带的重要水果番木瓜的生产受到严重影响 ,在众多方法防效不佳的情况下 ,利用病原获得抗性防治PRSV给番木瓜的生产带来了光明。综述了近年来转PRSVCP基因番木瓜中影响番木瓜转化因素和转基因番木瓜的抗性因素。转PRSV外壳蛋白 (CP)基因的番木瓜中多以胚性组织为转化材料 ,被转化材料的生理状态和基因型 ,是影响转化效率和转基因植株质量的主要因素。所获得的转基因番木瓜对PRSV的抗性在很大程度上依赖于接种PRSV与所转化PRSVCP基因的序列同源性、转基因拷贝数和所转基因的位置等。     

T4转基因番木瓜遗传性和果实品质分析

对T 4代转基因番木瓜进行了分子生物学和果实品质分析,结果表明,筛选获得的转基因番木瓜均为转番木瓜环斑病毒(PRV)复制酶突变体基因(RP),且对PRV抗性达到了高抗或免疫,RP基因在转基因植物中能稳定遗传至后代并在RNA水平上表达。在田间种植时,转基因木瓜的生长状况普遍好于普通番木瓜,尤其在生长后期(10月以后),普通番木瓜100%发病(大规模种植时),而大部分(约91.8%)转基因植株生长良好,果实较多且表面光洁、基本上无环斑。与非转基因亲本相比,T 4代转基因番木瓜的果实长度增加2.6%~5%,果实直径变小0.6%~1.5%,果肉厚度增加了12%~15%,因而果实形状与亲本相近或更好,且信用价值更高。转基因番木瓜果实中水分、蛋白质、氮、脂肪、还原性糖、维生素A、维生素C和类胡萝卜素的含量与对照都无显著性差异,即转基因番木瓜与亲本具有实质等同性,这表明转入的外源基因对番木瓜果实品质没有不良影响。     

转基因番木瓜的抗病性及分子鉴定

对T1代转番木瓜环斑病毒(PRV)复制酶(RP)突变体基因的两个番木瓜株系,进行了抗病性和分子生物学分析。结果表明,转基因番木瓜对PRV抗性达到高抗或免疫,目的基因RP遗传至转基因后代并在RNA水平表达,PCR可检测到CaMV35S启动子序列、标记基因NPTII。 Abstract:Virus resistance in field and molecular biological characterizations of the transgenes were analyzed for two lines of T1 generation of transgenic papaya with the replicase mutant gene from papaya ringspot virus (PRV).The transgenic plants showed highly resistant or immune against PRV.Results indicated that the transgenes inherited to and expressed at RNA level in the progenies.     

dsRNA介导的番木瓜环斑病毒（PRSV）的抗病性研究

以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana tabacum）及PRSV寄主植物番木瓜（CaricapapayaL.）作为试验材料,开展了番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因dsRNA介导的PRSV病原抗性的研究。利用农杆菌介导法将番木瓜环斑病毒外壳蛋白CP基因反向重复表达载体pHellsgate12-CPIR（简称PHG12-CPIR）分别转化到烟草和拟南芥中,获得阳性植株,并利用渗透法和农杆菌介导的瞬时表达体系将pHG12-CPIR载体导入到番木瓜中。对转基因植株进行攻毒试验并分析了其抗病性。在接种3~7d内,在拟南芥和番木瓜上转基因植株的发病情况较轻,而野生型植株叶片与转基因植株相比,均表现出不同程度的黄化、皱缩和枯斑等症状。在接种PRSV后,番木瓜和拟南芥转化植株表现症状的叶片的比例与对照相比,结果显著低于对照,而在烟草植株上症状表现的差异不明显。在3种植物上RT-PCR检测结果显示,在接种番木瓜环斑病毒PRSV后,野生型植株中有高浓度的病毒积累,而转pHG12-CPIR基因植株中几乎没有病毒积累,推测转pHG12-CPIR基因植株中瞬时表达系统已启动RNAi机制抑制了CP基因的表达。     

转基因番木瓜作为抗结核植物口服疫苗的初步研究

转基因植物疫苗的研制,可改变传统的疫苗接种方式和接种手段,大大降低疫苗的生产成本,具有广阔的应用前景。结核病的泛滥使抗结核的免疫预防急需开发新型的疫苗,研制抗结核的转基因植物疫苗具有重大的理论和实践意义。本文对具有良好免疫原性的结核杆菌分泌蛋白ESAT—6基因,进行了修饰改造,构建了带潮霉素选择抗性基因的植物表达载体和根癌农杆菌工程菌;采用叶盘法转化热带水果番木瓜,获得了13株抗性植株,通过PCR、Southern blot和RNA dot blot分子检测,确认了4株为转基因植株。番木瓜ESAT—6转基因植株的获得,为进一步的结核病植物口服疫苗的免疫研究和新型抗结核疫苗的研制与开发奠定了基础。     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因在转基因马铃薯中的表达

ＰＶＹ是马铃薯Ｙ病毒组的典型成员,主要感染马铃薯、番茄、辣椒和烟草等。近年来,利用植物基因工程手段获得了不少抗病毒转基因工程植物,为培育抗病毒作物新品种提供了新途径［１］。病毒外壳蛋白基因导入并使之在植物中表达可获得抗相应病毒的转基因植物,已在烟草、番茄、马铃薯、苜蓿、黄瓜和番木瓜等植物中获得成功［１～３］。本室已成功地对在我国流行的ＰＶＹＮ株系外壳蛋白基因进行了克隆及序列测定［４］,在此基础上,我们构建了植物表达中间载体,通过土壤农杆菌介导的叶盘法转化马铃薯,获得了大量转基因植株。分子检测证明…     

基因编辑产品检测技术研究进展

当前国内外生物技术产业革命加速推进,以基因编辑为代表的转基因新技术发展迅猛,新基因、新性状、新产品不断涌现。围绕基因编辑产品的检测方法将成为转基因生物安全监管的重要一环和有效支撑。因此,基于测序技术、酶切技术、PCR技术和其他检测技术4个方面,总结了目前应用于基因编辑产品检测的一些技术方法,并对每种方法的优缺点进行了分析,以期为今后基因编辑产品的检测提供思路,做好转基因监管技术储备。     

菲对转基因番木瓜进行大田种植试验

AgBiotech Reporter2005年22卷3期17页报道：已知环斑病毒是多年来美国夏威夷州番木瓜种植业减产的严重病害。近据菲律宾的非赢利机构菲律宾生物技术联合会（BCP）主席BienvenidoPecson博士宣称,为防止环斑病毒对番木瓜的危害,菲律宾正在培育可有效地抵抗环斑病毒的新的转基因番木瓜品种,并批准对其进行大田种植试验。此外,菲律宾农业、林业和天然资源研究和开发委员会（PCARRD）的科学家已对上述品种的基因进了鉴定。     

转基因作物中2种除草剂抗性基因aad1和dmo的PCR检测方法

【背景】抗除草剂转基因作物是全球种植面积最大的一类转基因植物,以除草剂抗性基因作为检测靶标的分子鉴定方法的研究与应用,对转基因生物安全的检测与监测有重要意义。【方法】根据除草剂抗性基因aad1和dmo的核苷酸序列设计PCR检测引物,并进行PCR反应体系优化、方法特异性、灵敏度、再现性等方面的测试,分别建立aad1基因和dmo基因的特异性PCR检测方法。【结果】建立的PCR检测方法在56~64℃的退火温度范围内均能获得一致性结果,具有良好的稳健性。该方法可将含有aad1基因和dmo基因的转基因作物与其他转基因作物区分开,其灵敏度可分别达到20个拷贝和40个拷贝。通过将aad1基因和dmo基因的检测引物放入同一管PCR反应体系中,还能在一次PCR中同时检测这2个靶标基因,双重PCR的检测灵敏度与单一PCR一致。【结论与意义】建立的分子方法可精准检测出含有aad1基因和dmo基因的转基因作物,具有特异性强、灵敏度高的特点,为抗除草剂转基因作物的筛选检测提供了可靠的技术支撑。     

番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因嵌合hpRNA载体一步快速构建及沉默效果的研究

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)严重威胁番木瓜种植业的发展,且目前没有十分有效的防治办法。病毒侵染植物依赖寄主因子的协助,真核翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)是多种RNA病毒侵染植物的必需因子。以番木瓜eIF4E家族基因为研究对象,构建同时干扰其eIF4E和eIFiso4E基因的发卡RNA(hairpin RNA,hpRNA)载体,并将其导入到番木瓜叶肉原生质中。通过荧光实时定量检测发现,番木瓜中eIF4E和eIFiso4E基因的表达量分别下降了49.8%和67.6%,这为进一步研究番木瓜eIF4E家族基因对PRSV侵染的影响以及利用RNA干扰技术靶向植物基因的病毒防治新策略提供理论和实践依据。     

加工产品中转基因玉米Bt11成分实时荧光PCR定量(性)检测

实验在玉米自身基因和外源基因的边界序列之间设计了具有品种和品系特异性的引物和探针 ,并以实时荧光PCR技术 ,建立了加工产品中转基因玉米Bt1 1成分品系鉴定检测和定量检测的方法。实验对加热条件和时间对检测转基因成分的影响作了探讨 ,并检测了部分市售食品和饲料。检测结果发现 ,加热时间温度越高、时间越长 ,对转基因成分定量检测的影响越大 ;在所检测的样品中可以检测出转基因玉米Bt1 1成分 ,有些样品还同时检出其他转基因成分。本研究实验建立的方法 ,可以用于加工产品中转基因成分的定量检测 ,也可以用于定性检测 ,或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法。     

转基因植物检测技术的研究进展

现代植物基因工程使转基因植物及其产品越来越多地进入人们的生活,转基因植物安全性在世界范围内引起了广泛关注,对转基因植物检测技术的需求也越来越紧迫。就转基因植物检测技术的研究进展进行综述,重点介绍以基因和蛋白为目标的检测技术,包括PCR、ELISA和基因芯片技术的最新进展,并对不同方法的优缺点进行对比。此外,提出对特定代谢产物的检测是转基因植物检测的重要组成部分,是以后检测技术的发展趋势之一。最后,以差异蛋白为检测目标,结合研究工作提出基于双向电泳技术的转基因植物检测方法及其产品溯源方案。     

转基因定量检测的不确定度研究

目前,欧盟、日本对转基因产品都实行基于转基因含量(阈值)强制标识制度。世界各国都采用实时荧光PCR方法来开展食品成分的相对定量检测工作,以样品的内、外源基因的拷贝数之比来近似代表样品中的转基因质量分数。为了便于用户正确理解检验结果,在转基因定量检测结果报告中必须报结果的不确定度,分析了转基因定量的不确定度来源,参照化学分析中的有关方法,给出了转基因定量检测中外源基因和内源基因的标准曲线的不确定度测算公式,并以转基因大豆为试材,利用方法的室内验证数据进行不确定度计算,可供相关实验室参考。     

应用实时荧光PCR技术定性定量检测改良品质的转基因小麦

目的:对转入高分子量谷蛋白亚基的小麦中转基因成分进行实时荧光PCR定性定量检测。方法:针对转基因小麦品系中通用的ubiquitin启动子,NOS终止子以及标记基因bar基因进行定性筛选检测,同时用已知为单拷贝的Wx012基因作为小麦物种内源特异参照基因,用单粒B73转基因小麦提取基因组DNA建立内源基因和外源基因的标准曲线,对转基因小麦样品A进行定量检测,同时优化实时荧光PCR条件反应条件。定量检测结果为5.35%。结果:研究的实时荧光PCR技术对转基因小麦中转基因成分能够快速准确地进行定性定量检测。     

应用荧光原位杂交技术检测人β^E珠蛋白基因小鼠染色体上的整合状态

为将荧光原位杂交技术应用于基因定位研究中,探讨一种能有效地检测转基因动物染色体上外源基因整合状态的实验方法,对小鼠腹腔注射秋水仙素后,取转基因小鼠骨髓制备中期染色体,将传统的FISH方法加以改进,检测外源基因在转基因小鼠染色体上的整合状态。检测结果表明,外源人β^E珠蛋白基因已稳定地整合于小鼠染色体上,FISH能直观地反映外源基因在转基因动物染色体上的整合状态,该方法可对转基因动物及基因转移研究中的外源基因整合反进行染色体定位检测。     

转基因水稻“科丰6号”实时荧光PCR定性定量检测方法研究

旨在建立转基因水稻"科丰6号"外源基因和边界序列的实时荧光PCR检测方法,为科丰6号定性定量检测提供技术支持。根据外源基因和边界序列信息,设计实时荧光PCR探针引物,优化体系,对不同转基因产品和不同转基因含量的"科丰6号"水稻进行检测。结果显示,所设计的引物探针具有很好的特异性,与其他转基因水稻品系、转基因玉米、转基因棉花、转基因番茄和非转基因水稻均无非特异性反应,对转基因水稻"科丰6号"的检测灵敏度达到0.01%。建立的科丰6号实时荧光PCR检测方法重复性好、灵敏度高,能够达到目前国际上转基因产品定量检测的标准,为该水稻品系的定性定量检测提供技术支持。     

番木瓜果实扩展蛋白Cp-EXP1基因表达的荧光定量PCR分析

目的：对番木瓜果实扩展蛋白Cp-EXP1的基因进行荧光定量PCR分析,以便对其功能做进一步研究。方法：以不同成熟阶段的番木瓜果实总RNA为模板,设计引物进行荧光定量PCR。结果：Cp-EXP1基因在不同成熟阶段的番木瓜果实中的表达是有差异的,其表达水平受乙烯调控。结论：Cp-EXP1基因的表达与番木瓜的成熟软化密切相关,其表达分析为研究番木瓜的生长发育及其品种改良打下了良好的基础。     

烟草MnSOD基因在保定苜蓿中的转化

通过农杆菌介导的转基因方法 ,将烟草MnSOD基因的cDNA序列导入保定苜蓿中 ,成功地诱导了转基因植株的再生。转基因植株生长和发育良好 ,NPTⅡ基因和MnSOD基因的PCR检测和Southern杂交表明MnSOD基因已经导入到保定苜蓿的再生植株中 ,MnSOD活性检测表明部分转基因植株的MnSOD活性显著高于对照植株     

多重PCR在烟草转基因检测中的应用

通过添加PCR增强剂DMSO,优化了检测转基因烟草中外源基因35S启动子、NPT Ⅱ基因和NOS终止子的PCR体系.将多重PCR应用于烟草转基因检测,实现了同一反应中可以检测35S启动子与烟草内源基因硝酸还原酶(NR)或NPT Ⅱ基因和NOS终止子.通过对待检样品试验,该方法稳定、可靠.