利用套叠PCR和高保真DNA聚合酶进行基因多位点突变的研究

利用套叠PCR和高保真DNA聚合酶对人工合成的牛口蹄疫病毒VPI基因(FMDV-VPI,Foot-Mouth Disease Vims-VPI)的5个突变位点进行修复,修复的成功率为100％。     

A、O型FMDVT／B细胞抗原表位融合基因合成及植物表达载体构建

人工合成A、O型FMDV的7个细胞表位基因,应用套叠PCR将其中5个T细胞表位基因融合为T,2个B细胞表位基因融合为B,分别克隆进pMD-18T载体,再利用同尾酶的酶切及连接构建了不同组合的克隆载体(pMD-BT/BTT),然后将克隆载体改造为中间载体(pMD-xsB/xsT/xsBT/xsBTT),最终获得4个重组植物表达载体(pBI-xsB/xsT/xsBT/xsBTT).这为进行热研2号柱花草遗传转化及进一步研究同型与异型FMDV之间多表住基因的不同融合方式的免疫效果奠定了基础.为口蹄疫可饲植物疫苗的应用研究提供借鉴.     

转基因番木瓜作为抗结核植物口服疫苗的初步研究

转基因植物疫苗的研制,可改变传统的疫苗接种方式和接种手段,大大降低疫苗的生产成本,具有广阔的应用前景。结核病的泛滥使抗结核的免疫预防急需开发新型的疫苗,研制抗结核的转基因植物疫苗具有重大的理论和实践意义。本文对具有良好免疫原性的结核杆菌分泌蛋白ESAT—6基因,进行了修饰改造,构建了带潮霉素选择抗性基因的植物表达载体和根癌农杆菌工程菌;采用叶盘法转化热带水果番木瓜,获得了13株抗性植株,通过PCR、Southern blot和RNA dot blot分子检测,确认了4株为转基因植株。番木瓜ESAT—6转基因植株的获得,为进一步的结核病植物口服疫苗的免疫研究和新型抗结核疫苗的研制与开发奠定了基础。     

番木瓜中6个BG生物合成相关基因荧光定量分析

异硫氰酸苄酯(benzyl isothiocyanate,BITC)是医学界公认的具有防癌抗癌活性的成分,对多种癌症具有很好的作用.BG是BITC的前体物质,可以在芥子酶的作用下水解生成BITC.研究表明,BG在热带水果番木瓜中含量丰富.本研究在克隆了番木瓜中6个相关基因和测定了BG在番木瓜不同组织中含量的基础上,采用实时荧光定量PCR技术,对6个基因在番木瓜不同组织中的表达量进行测定,并与BG的含量进行比较,考察其相关性.结果表明各基因的表达量相对较高时BG的含量也较高,即6个基因在番木瓜中的表达量与BG的含量存在相关性.我们推测,这6个基因可能是番木瓜中BG生物合成相关基因.本文结果为进一步研究基因的功能提供了理论依据.     

植物病毒载体系统研究进展

植物病毒基因组小,易于进行遗传操作而且感染过程简单,因而利用植物病毒载体表达外源基因在生物技术领域具有潜在的应用优势。本文主要介绍了抗原展示系统和多肽表达系统,并分别列举一些植物病毒作为表达载体的研究进展情况以及应用前景。     

以P型职PRSV-VPg为模板多位点突变获得W型PRSV-VPg的研究

以P型PRSV-VPg(Papaya Ringspot Virus,VPg gene)基因为模板利用高保真酶通过两对引物(突变4个位点),PCR扩增获得一条276 bp和一条141 bp的两个小片段.以此为基础,利用长引物延伸和套叠PCR的方法,定点突变剩余5个位点,最后拼接获得W型PRSV-VPg基因.结果表明通过上述方案可以成功改造P型PRSV-VPg基因,获得与W型朋PRSV-VPg同源的目的基因,成功率为100%.该技术可以绕开传统的通过寻找毒源进行RT-PCR方法和人工合成方法获得病毒基因,其技术操作简单,且节约时间和成本,并在人工合成基因、多位点基因定点突变等方面具有很好的借鉴作用和应用价值.     

烟草脆裂病毒诱导的基因沉默在植物基因功能研究中的应用

烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,TRV)是一类应用比较广泛而且效率和持久性较好的病毒载体,能够介导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状。改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染,也可以鉴定宿主植物生长点的基因,因此TRV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。该文介绍TRV沉默载体的构建、诱导基因沉默原理、在植物基因功能研究中的应用以及优缺点。     

植物病毒诱导的基因沉默在基因功能研究中的应用

传统的植物遗传转化方法周期长、工作量大、过程繁琐,不利于基因功能的快速高通量鉴定．近年来随着基因沉默机制研究的深入和不断发展,利用病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)进行植物功能基因组研究作为一种快速、高通量的反向遗传学工具已被广泛应用在烟草、马铃薯、番茄等植物中, 在大规模的植物基因组功能鉴定中展示了广阔的应用前景．综述了 VIGS 的作用机制、植物病毒栽体、转化方法以及在植物基因功能研究等方面的应用及前景．     

A、O型口蹄疫T/B细胞多抗原表位融合基因植物表达载体的构建

通过对(pMD-xsB/xsT/xsBT/xsBTT)4个克隆载体进行PCR,在(xsB/xsT/xsBT/xsBTT)目的基因前接入引导肽序列(用Y表示),克隆中间载体(pM D-xsY B/xsYT/xsYBT/xsYBTT),再利用同尾酶的酶切及连接得到4个重组植物表达载体(pBI-xsYB/xsYT/xsYBT/xsYBTT).经限制性酶切鉴定和测序分析证实表达载体构建正确,为下一步热研2号柱花草转基因植株的获得奠定了基础.     

马铃薯X病毒载体介导的乙肝病毒表面抗原在烟草中的表达

目的:利用马铃薯X病毒(PVX)表达载体,在本生烟草中表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg),为生产植物疫苗提供一条快速高效的新途径.方法:将HBsAg基因克隆进PVX表达载体,电转化农杆菌,侵染本生烟的叶片、茎和根.结果与结论:采用ELISA检测重组HBsAg的表达水平,SDS-PAGE确认其大小,Western印迹分析表明重组蛋白可与鼠抗HBsAg单克隆抗体发生特异性反应.HBsAg蛋白表达量在幼小叶片中远高于已伸展的叶片,在叶片中的表达量远高于茎根;表达量会随侵染后时间发生一定的变化,但因植株而异;重组蛋白在可溶性蛋白中的含量最高可达796.81 ng/mg.