分子生物学在石油微生物多样性研究中的应用

该文较系统地概述了目前以16SrRNA为基础的核酸探针检测技术、利用引物的PCR技术、DNA序列分析技术和电泳分离及显示技术在油藏微生物群落多样性和石油环境污染研究中的研究进展,并探讨了未来分子生物学技术在石油微生物研究中的发展方向。     

微生物分子生态技术:16S rRNA/DNA方法

综述了以 1 6SrRNA/DNA为基础的分子生物学技术在环境微生物种群分析中的应用 ,目的是使相关的科研人员能够对 1 6SrRNA/DNA技术有一个比较完整的了解 ,并可以开展初步的实验工作。主要内容包括 :DNA指纹技术、 1 6SrDNA文库的建立、DNA测序及微生物分类鉴定 (即系统发育树分析 )、基因探针设计和测试、荧光原位杂交和核酸印迹杂交等。     

蝗虫肠道微生物总DNA提取方法的比较

采用Bead beating法和QIAamp DNA stool mini kit法提取蝗虫肠道微生物总DNA,并对2种方法提取DNA的得率、完整性以及16SrRNA基因扩增产物的变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)图谱等进行综合比较。结果表明,Bead beating法提取DNA的得率显著高于QIAamp DNA stool mini kit法(P=0.042),而QIAamp DNA stool mini kit法提取DNA片段更完整。PCR-DGGE检测微生物多样性结果显示,QIAamp DNA stool mini kit法提取DNA所代表的微生物群落多样性略高于Bead beating法,但Mann-Whitley统计学检验表明用2种方法检测蝗虫肠道微生物多样性无显著差异(P=0.17)。因此在蝗虫肠道微生物群落多样性的检测中QIAamp DNA stool mini kit法具一定的优势,而Bead beating法同样适用。     

微生物非培养鉴定技术在临床标本检查中的应用研究

感染性疾病的病原学诊断仍以微生物的分离培养作为“金标准”,但能培养成功的仅为少数。绕过分离培养环节,以微生物rRNA／rDNA基因作为种属鉴别序列,设计通用引物（universal primer,up）,用PCR扩增标本中微生物的16SrRNA或16S～23SrRNA序列,通过毛细管电泳（CE）进行单链构象多态性（SSCP）和限制性片段长度多态性（RFLP）分析,筛选基因的点突变以达到快速鉴定微生物（到属和种）。用PCR—CE—SSCP和PCR—CE—RFLP分析系统检测了呼吸道、消化道、女性生殖道标本中感染的病原菌;用PCR-CE-SSCP系统检测了男性泌尿道溶脲脲原体两个生物群。建立PCR—CE—RFLP分析系统,用非培养法鉴定技术检测脓汁、肠道和泌尿生殖道标本,检测并鉴定了临床标本中的多种病原菌;对人体肠道菌群进行定性和定量分析,用该法可协助腹泻的病原学诊断;检测生殖道常见的致病菌;用PCR—CE—SSCP系统建立了检测溶脲脲原体两个生物群的方法。微生物的非培养鉴定技术比传统方法缩短20h,为临床感染症的诊断提供快速、准确的依据。结果可见,利用16S～23SrRNA间区基因PCR—CE—RFLP和PCR—CE—SSCP系统可以达到对临床常见病原菌的快速种属鉴定,比传统的细菌培养法具有快速、准确、灵敏的优点,可用于临床感染症的病原学诊断。微生物的非培养鉴定技术将替代培养法而成为病原学诊断新的金标准。     

微生物测序分型系统——基于美国应用生物系统公司基因分析仪的MicroSeq微生物鉴定系统

当微生物危害人类健康时,需要依靠高效、快速、高精确性的微生物鉴定系统检测。为了获得可靠的结果,越来越多的制药公司、食品企业和公共卫生实验室、相关医院卫生系统依靠DNA测序法来进行微生物鉴定。DNA测序鉴定方法已经被证明比传统的生化分型和表型分型方法更加准确、快捷,尤其在其他方法分型失败时特别有价值。16SrRNA基因是伯杰方法（Bergey’Manual）细菌菌种分类的客观基础,也是DNA测序鉴定分型的基础。     

一种直接用于PCR扩增的山羊瘤胃微生物DNA提取方法的建立

目的建立提取高质量的瘤胃微生物DNA的方法,为采用免培养技术研究山羊瘤胃微生物奠定基础。方法采集山羊瘤胃内容物,用SDS高盐法提取微生物总DNA,以通用引物扩增细菌和古细菌的16SrDNA。结果提取到的瘤胃微生物总DNA片段大于23kb,PCR能够扩增出细菌和古细菌的16SrDNA片段。结论用该提取方法得到的山羊瘤胃微生物总DNA能够满足后续实验的需要。     

DNA聚合酶对PacBio SMRT测序结果影响的评价

目的评估不同DNA聚合酶是否会对以16SrRNA全长为测序靶点的肠道微生物多样性研究结果产生影响。方法用美国太平洋公司的三代测序仪(PacBio single molecule real-time sequencing technology)对3份分别采用KAPA HiFi^TM HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶扩增的军犬粪便样品进行精确至"种"水平的测序分析。结果经配对Mann-Whitney U检验显示,不同DNA聚合酶扩增的同一样品在门、属和种水平上差异无统计学意义(P>0.05),然而在某些相对含量较少的操作分类单元(OTU)上,其扩增效率存在差异。经基于非加权UniFrac距离的非加权组平均法聚类分析和基于加权UniFrac距离的非参数多元方差分析发现不同DNA聚合酶扩增的同一样品其多样性差异无统计学意义(P>0.05)。结论 KAPA HiFi^TM HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶虽对模板DNA扩增存在一定的偏好性,但该偏好性不影响PacBio SMRT测序结果。     

空气环境中几种细菌检测与16S rRNA测序鉴定

采集空气环境微生物,根据菌落和革兰氏染色特征,分离5株细菌。提取分离株DNA,采用设计的16SrRNA引物扩增DNA片段;纯化PCR产物,进行测序反应并再纯化,上机读序。拼接与校对DNA序列,在NCBI网站进行Blast,鉴定细菌型别。5株菌株分别是表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、施氏假单胞菌、溶血葡萄球菌和大肠杆菌;其中溶血葡萄球菌是致病菌,其他4株是条件致病菌。这提示,应警惕空气环境中致病菌的感染。     

DNA提取对微生物多样性测序分析的影响

运用高通量测序技术分析复杂样品中微生物种群的变化情况,已经成为目前微生物研究领域的热点问题之一。而微生物的样品准备,如DNA提取和16S可变区的扩增等,对于测序完成后的数据分析以及微生物原始群落组成的影响是至关重要的。采用国产试剂盒(天根土壤微生物基因组提取试剂盒)和进口试剂盒(MOBIO土壤微生物基因组提取试剂盒)分别对土壤样品和羊瘤胃食糜样品进行DNA提取。然后选取总DNA起始量为25ng,对16S V3可变区进行PCR扩增和文库构建,最后通过数据分析比较不同试剂盒提取的DNA对微生物多样性变化的影响,包括OTU数目、稀释曲线、微生物数量及物种种类等。研究发现,在相同DNA模板量和PCR条件下,进口试剂盒提取的DNA能够获得更多的微生物种类。     

未培养微生物的研究与微生物分子生态学的发展*

近年来现代分子技术和基因组学逐渐渗透到有关生命科学的整个领域,也为微生物生态学提供了新的研究方法和机遇。16S rRNA基因序列分析、DNA-DNA杂交、核酸指纹图谱以及宏基因组学等分子技术检查自然环境中的微生物,可以克服传统纯培养技术的不足,是一条探知未培养微生物、寻找新基因及其产物的新途径,开启了我们认识微生物多样性和获得新资源的大门。