肠道硫酸盐还原菌DGGE分析技术的建立

目的 建立分析肠道内硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing bacteria,SRB)组成的变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术,并用于分析10例健康人粪便样品中的SRB组成.方法 从GenBank中下载13株脱硫弧菌科细菌的腺苷酰硫酸还原酶α亚基基因(aprA)的序列,利用Clustal X、Simulated PCR (SPCR)软件比较、评估了2对针对aprA 基因的引物(AprA-3-FW/APS-RV和AprA-1-FW/AprA-5-RV)用于扩增粪便样品中的SRB的特异性.确定PCR引物和条件,进一步摸索并建立DGGE分析体系.结果 Clustal X和SPCR软件分析的结果均表明引物AprA-3-FW/APS-RV优于AprA-1-FW/AprA-5-RV.实际PCR的结果也显示AprA-1-FW/AprA-5-RV扩增效率低并有非特异扩增.建立DGGE体系,对10例健康人肠道中SRB的分析显示,每个个体肠道中SRB的种类有l到5种不等.结论 基于aprA序列的DGGE技术是分析肠道SRB组成的有效方法.     

中华稻蝗AFLP反应体系的建立与优化

以中华稻蝗为研究材料,提取到高质量的总DNA.通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等实验条件,确定了AFLP银染技术方法,从而建立了中华稻蝗AFLP分子标记研究体系,得到了清晰的AFLP指纹图谱,为探讨稻蝗种间遗传学关系提供了新的技术手段.     

定量PCR比较两种苦瓜制品对人肠道菌群结构的体外调节作用

目的通过体外厌氧培养联合定量PCR的方法比较两种不同的苦瓜制品,苦瓜全粉（Bitter melon power。BMP）和苦瓜乙醇提取物（Bitter melon ethanol extract,BME）,对健康人和2型糖尿患者肠道菌群结构的调节作用。方法采集一名健康个体和一名2型糖尿病个体的新鲜粪便样品,在体外厌氧的条件下与不同浓度的BMP或BME共培养,收集0、12、24、48h的菌体沉淀。采用定量PCR的方法,检测乳杆菌属细菌、双歧杆菌属细菌、丁酸盐产生菌、硫酸盐还原菌和肠杆菌科细菌这5类细菌在总菌中相对含量的变化。结果培养过程中,双歧杆菌属细菌、硫酸盐还原菌和肠杆菌科细菌在两名个体培养样本中表现出类似的生长趋势,而乳杆菌属细菌和丁酸盐产生菌则有差异。相同培养时间下,与对照组相比,BMP和BME在两名个体的培养样本中均能富集乳杆菌属细菌、双歧杆菌属细菌和丁酸盐产生菌,并抑制肠杆菌科细菌,但是只有BMP15mg／mL能持续抑制硫酸盐还原菌。相同浓度之下,BMP对菌群结构的调节效果比BME显著。结论来自不同个体的相同肠道细菌类群可能呈现不同的体外生长趋势,但BMP和BME均能对同一细菌类群起到类似的调节作用;且相较于BME,BMP通过富集一些有益细菌并抑制机会致病细菌从而改善肠道菌群结构的效果更显著。     

中华稻蝗不同地理种群遗传多样性的AFLP分析

为研究中华稻蝗种群遗传多样性和遗传结构, 文章对我国7省市的7个中华稻蝗种群进行AFLP分析。选取7对引物扩增128个个体, 共产生336条带, 多态性条带292条, 占86.90%。结果表明: 中华稻蝗种群具有较高的遗传多样性水平, 其中海南万宁种群的遗传多样性高于其他各种群。Mantel检验(r=0.27, P=0.89)表明中华稻蝗各种群遗传距离与地理距离间没有显著相关性。种群间具有明显的遗传分化现象。UPGMA(Unweighted pair group method average)聚类分析显示, 7个中华稻蝗种群按地理距离分为3支: 北方北京昌平、山西太原和山东济宁为一支; 南方陕西汉中、湖南长沙和广西来宾为一支; 海南万宁单独为一支。上述结果以及PCA(Principal component analysis)分析均表明由于地理隔离中华稻蝗种群显示出明显的南北分化和岛屿大陆种群遗传分化现象。     

蝗虫肠道微生物总DNA提取方法的比较

采用Bead beating法和QIAamp DNA stool mini kit法提取蝗虫肠道微生物总DNA,并对2种方法提取DNA的得率、完整性以及16SrRNA基因扩增产物的变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)图谱等进行综合比较。结果表明,Bead beating法提取DNA的得率显著高于QIAamp DNA stool mini kit法(P=0.042),而QIAamp DNA stool mini kit法提取DNA片段更完整。PCR-DGGE检测微生物多样性结果显示,QIAamp DNA stool mini kit法提取DNA所代表的微生物群落多样性略高于Bead beating法,但Mann-Whitley统计学检验表明用2种方法检测蝗虫肠道微生物多样性无显著差异(P=0.17)。因此在蝗虫肠道微生物群落多样性的检测中QIAamp DNA stool mini kit法具一定的优势,而Bead beating法同样适用。