蓝细菌Synechocystis PCC 6803染色体上的基因ssl2138和sll1092构成的毒素-抗毒素系统

摘要:【目的】证明集胞藻(Synechocystis)PCC 6803染色体上的假定基因ssl2138和sll1092构成vapBC家族的毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TA系统)。【方法】以RT-PCR分析ssl2138和sll1092的共转录,以选择性表达系统分析其编码产物对大肠杆菌生长的影响,并通过亲和层析和质谱检测证明编码产物之间的相互作用。【结果】ssl2138和sll1092构成的二元操纵子在正常生长条件下共转录;Sll1092表达抑制大肠杆菌的生长,Ssl2138的同时表达或随后表达可拮抗Sll1092的生长抑制作用;Ssl2138与Sll1092相互作用形成复合体。【结论】位于同一操纵子中的假定基因ssl2138和sll1092构成vapBC家族的TA系统。     

对硝基苯酚对细菌产生持留菌的影响及其相关机制

【目的】研究对硝基苯酚(PNP)对大肠杆菌和铜绿假单胞菌产生持留菌的影响,并对转录组进行分析,阐明对硝基苯酚影响持留菌形成的相关机制。【方法】采用氧氟沙星抗生素探究对硝基苯酚对细菌产生持留菌的影响,并通过检测细菌自溶情况和呼吸抑制剂羰酰氰氯苯腙(CCCP)对持留菌比例的影响,然后通过转录组分析其相关基因的表达,最后通过实时荧光定量PCR和反义核酸进行相关功能基因的验证。【结果】PNP可以通过抑制大肠杆菌和铜绿假单胞菌的呼吸作用使其产生持留菌的比例增加,PNP不同浓度、作用不同时间和作用不同生长时期的菌体都会影响细菌产生持留菌的比例。PNP和呼吸抑制剂CCCP均能够抑制2个菌体的自溶情况,包括溶解氧含量的变化、蛋白质降解情况、细胞尺寸的变化和RNA完整性。转录组分析和实时荧光定量PCR实验结果表明加入PNP后,cyo A、app C两个基因在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中的表达量均显著下降,再通过反义核酸抑制cyo A、app C的表达发现持留菌的比例和原始菌株相比均有所增加。【结论】PNP可以通过抑制细胞呼吸作用来增加细菌产生持留菌的比例。     

温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨

【目的】L-丙氨酸的存在导致Escherichia coli的生长速率显著降低,最终会降低发酵过程中L-丙氨酸的体积合成速率。用温度调节基因开关(λpR-pL)高效、动态调控重组E. coli菌株菌体生长与L-丙氨酸合成过程,使两者相协调。【方法】以野生型E. coli B0016为出发菌株,敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径以及丙氨酸消旋酶编码基因(ackA-pta、pflB、adhE、frdA、ldhA、dadX),获得菌株B0016-060B。将嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的L-丙氨酸脱氢酶基因(alaD)克隆于pL启动子下游,并在B0016-060B菌株中表达,获得菌株B0016-060B/pPL-alaD,进行摇瓶和发酵罐发酵考察菌体生长和L-丙氨酸发酵性能。【结果】竞争代谢途径的敲除显著降低了副产物合成量,仅形成极少量的乙酸、琥珀酸和乙醇。28 °C下菌株B0016-060B/pPL-alaD几乎不合成L-丙氨酸,可保证菌体快速生长;而在42 °C下可高效合成L-丙氨酸。经发酵罐发酵,可合成67.2 g/L L-丙氨酸,体积生产强度达到2.06 g/(L·h)。【结论】通过发酵培养温度的简单切换,分阶段实现了细胞的快速增量和L-丙氨酸的高强度合成。     

产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能

【背景】大肠杆菌由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸生产菌。【目的】敲除大肠杆菌Escherichia coli THR苏氨酸合成途径的非必需基因,并异源表达苏氨酸合成必需的关键酶,构建一株苏氨酸高产菌株。【方法】利用FLP/FRT重组酶系统,敲除E. coli THR中lysC、pfkB和sstT,同时进行谷氨酸棒杆菌中lysC~(fbr)、thrE和丙酮丁醇梭菌中gapC的重组质粒构建并转化到宿主菌中。【结果】以E. coli THR为出发菌株,敲除其苏氨酸合成途径中表达天冬氨酸激酶Ⅲ (AKⅢ)的基因lysC、磷酸果糖激酶Ⅱ基因pfkB及苏氨酸吸收蛋白表达基因sstT,使菌株积累苏氨酸的产量达到75.64±0.35g/L,比出发菌株增加9.9%。随后异源表达谷氨酸棒杆菌中解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶(lysC~(fbr))、苏氨酸分泌转运蛋白(thrE)及丙酮丁醇梭菌中由gapC编码的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶,获得重组菌株E. coli THR6菌株。该菌株积累苏氨酸的产量提高到105.3±0.5 g/L,糖酸转化率提高了43.20%,单位产酸能力提高到5.76 g/g DCW,最大生物量为18.26 g DCW/L。【结论】单独敲除某个基因或改造某个途径不能使苏氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建苏氨酸工程菌的最有效方法。     

rmlA 基因缺失影响禽致病性大肠杆菌的生物被膜形成

【目的】构建禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)rmlA基因缺失株,研究该缺失株的生物学特性。【方法】利用Red重组系统构建rmlA缺失株;比较野生株与缺失株在生长特性、运动性和生物被膜形成能力等方面的差异;运用Real-time PCR技术,比较野生株与rmlA缺失株对APEC部分毒力基因转录的影响。【结果】rmlA缺失株,不影响APEC的生长和运动特性,但生物被膜形成能力显著增强,且使luxS、irp2基因转录水平分别上调2倍、1.8倍,iucD、fyuA则下调25倍。【结论】APEC的rmlA基因可以影响禽致病性大肠杆菌的生物被膜形成能力及部分毒力基因的转录水平;而对APEC的生长、运动特性没有影响。     

禽致病性大肠杆菌gspL基因缺失株构建及生物学特性

【目的】研究gsp L基因缺失对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)生物学特性的影响。【方法】利用Red重组方法构建禽致病性大肠杆菌DE17株的gsp L缺失株;分析野生株与缺失株的生长特性、黏附和入侵DF1细胞的差异;采用荧光定量PCR的方法比较野生株和缺失株毒力基因转录水平的变化;比较野生株与缺失株的半数致死量(LD50)差异。【结果】gsp L缺失不影响DE17的生长特性,但其黏附和入侵DF1细胞能力显著下调。荧光定量PCR检测结果表明,缺失株毒力基因lux S,pfs,fyu A和iss转录水平明显上调,tsh的转录水平明显下调,而vat,ibe A,stx2f和omp A的转录水平无显著变化;LD50检测结果表明,缺失株比野生株毒力增强了12倍。【结论】gsp L基因的缺失不影响禽致病性大肠杆菌的生长特性,但能减弱其黏附和入侵能力,且可以正调控禽致病性大肠杆菌部分毒力基因的转录水平,推测gsp L基因可能与APEC对宿主的致病性有关。     

苏云金芽胞杆菌bkd基因簇的转录调控

【目的】通过分析苏云金芽胞杆菌bkd基因簇的转录调控和bkdR突变体的表型特征,明确bkdR所在基因簇的转录调控机制和对Cry蛋白产量的影响。【方法】通过生物信息学方法分析bkdR所在基因簇的结构,RT-PCR分析基因簇的转录单元,采用同源重组技术敲除苏云金芽胞杆菌HD73菌株的bkdR基因,利用启动子融合lacZ的方法分析启动子的转录活性。利用总蛋白定量确定Cry1Ac蛋白产量。【结果】bkd基因簇由8个基因组成,其中ptb-bkdB7个基因组成1个转录单元。ptb基因的启动子转录活性在sigL和bkdR突变体中均明显降低。bkdR基因的缺失对菌体生长、芽胞形成率和Cry1Ac蛋白产量无影响,但使运动能力减弱。【结论】bkd操纵子受Sigma 54控制,并由BkdR激活,bkdR基因的缺失对Cry蛋白产量无影响,对菌株的运动能力有影响。     

应用基因敲除快速构建大肠杆菌突变体改造脂肪酸代谢途径

【目的】基因敲除技术是研究基因功能的重要手段。我们试图建立一种快速、高效的大肠杆菌基因敲除方法。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113单基因缺失体Keio文库,将经典的Red同源重组技术与P1噬菌体转导技术相结合,对E.coli MG1655脂肪酸代谢基因进行快速敲除。【结果】获得了大肠杆菌β-氧化途径的缺失菌株△fadD、△fadE和△fadD-△fadE;脂肪酸合成途径缺失菌株△fabH、△fabF和△fabH-△fabF。敲除fadD和fadE对生长情况没有影响;敲除fabH后,生长速度明显减慢;敲除fabF对生长几乎没有影响。FadD、FadE及双敲缺失体的脂肪酸含量18.2 mg/L、20.0mg/L和19.2 mg/L,略高于野生型17.5 mg/L;FabH、FabF及双敲缺失体的含量分别为12.6 mg/L、15.2 mg/L和11.2 mg/L,明显低于野生型。【结论】在单基因突变体文库基础上,利用P1噬菌体转导、Red同源重组和抗性基因消除进行基因敲除,简化了构建大肠杆菌单基因和多重突变体的方法。     

双组份系统YvcPQ抑制苏云金芽胞杆菌的芽胞形成

【目的】探究双组份系统YvcPQ影响芽胞形成的机制。【方法】利用β-半乳糖苷酶活性实验验证YvcP对芽胞形成抑制因子KapD的调控作用;通过无痕基因敲除并分别比较突变株与出发菌株的芽胞产率,研究YvcPQ及KapD对芽胞形成的影响;应用细菌单杂交实验、EMSA实验和实时荧光定量PCR技术探究转录调控因子AbrB对yvcPQ操纵子的转录调节。【结果】YvcP可以正调控kapD的表达,从而抑制芽胞形成;yvcPQ不能受YvcP的自调控,而是受AbrB转录激活。【结论】调控因子AbrB能够通过正调控yvcPQ操纵子的转录来提高细胞内YvcP的含量,进而增强YvcP对芽胞形成抑制因子编码基因kapD的表达,最终抑制芽胞的形成。     

comE基因缺陷影响肺炎链球菌体内诱导基因的表达

【目的】筛选受comE调控的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)体内诱导基因。【方法】通过插入失活构建基因comE缺陷的S.pn菌株,与野生菌株分别腹腔注射BALB/c小鼠,经过体内诱导后取小鼠血,分离细菌提取RNA,用RT-PCR法检测13个体内诱导基因mRNA水平差异。【结果】将RT-PCR结果通过Quantity-one灰度分析,进行配对t检验,显示8个体内诱导基因在缺陷菌株和野生菌株中mRNA表达水平具有统计学差异(P0.05),其中spd-0300、spd-0414、spd-0622、spd-1663、spd-1719、spd-0235、spd-0873受转化上调,spd-1672受转化下调。【结论】筛选出受转化调控的体内诱导基因spd-0300、spd-0414、spd-0622、spd-1663、spd-1719、spd-0235、spd-0873、spd-1672,它们可能参与生长调节、温度感应、糖脂代谢等环节,表明细菌转化可通过调节某些体内诱导基因的表达来增强细菌的毒力。     

转录后水平沉默与基因表达

基因沉默是1个非常复杂和普遍的现象。转录后水平的基因沉默是指转基因在细胞核里能稳定转录,细胞质里却无相应的稳定态mRNA存在的现象。它往往被称为共抑制、静息作用或RNA干预等。本文介绍了转录后水平的基因沉默现象的发现、分子机理和应用等方面的进展。提出了克服转录后水平基因沉默的一些对策。     

Horizontal gene transfers as metagenomic gene duplications

While it is well accepted that horizontal gene transfer plays an important role in the evolution and the diversification of prokaryotic genomes, many questions remain open regarding its functional mechanisms of action and its interplay with the extant genome. This study addresses the relationship between proteome innovation by horizontal gene transfer and genome content in Proteobacteria. We characterize the transferred genes, focusing on the protein domain compositions and their relationships with the existing protein domain superfamilies in the genome. In agreement with previous observations, we find that the protein domain architectures of horizontally transferred genes are significantly shorter than the genomic average. Furthermore, protein domains that are more common in the total pool of genomes appear to have a proportionally higher chance to be transferred. This suggests that transfer events behave as if they were drawn randomly from a cross-genomic community gene pool, much like gene duplicates are drawn from a genomic gene pool. Finally, horizontally transferred genes carry domains of exogenous families less frequently for larger genomes, although they might do it more than expected by chance.     

基因治疗中外源基因的导入

基因治疗是将遗传物质导入靶细胞以达到治疗疾病的目的,目前基因治疗研究中的主要障碍是如何格外源基因导入靶细胞。本介绍基因治疗的原理和外源基因导入靶细胞时的常用方法,包括显微注射法、电穿孔法、基因枪粒子轰击法等。对基因治疗的现状、存在的问题及未来发展前景作了简要探讨。     

Human globin gene expression after gene transfer

Human globin genes can be transferred into mouse and human erythroid cells in culture, and can be appropriately expressed at the mRNA level in these cells. A plasmid containing a human beta globin gene is expressed in mouse erythroleukemia cells (MELC), and another containing a human epsilon or gamma gene is expressed in human erythroleukemia (K562) cells. A neomycin resistance (neoR) gene on the plasmids has been used to select for those cells containing the transferred globin genes; this selection may favor the expression of the globin genes by providing chromosomal positions requiring neoR expression. Analyzing clones resistant to G418, a neomycin analogue, demonstrated globin mRNA expression and induction. Retroviral vectors have also been used to transfer and appropriately express human beta genes in MELC. In addition, a plasmid containing a dihydrofolate reductase (DHFR) gene as well as neoR and beta globin genes has been used to amplify and express beta globin mRNA in MELC. These experiments suggest that high level appropriate expression of human beta globin genes is feasible and provides potentially useful approaches to the long-range goal of gene therapy for sickle cell anemia and beta thalassemia.     

SNAPper: gene order predicts gene function

SNAPper is a network service for predicting gene function based on the conservation of gene order. AVAILABILITY: The SNAPper server is available at http://pedant.gsf.de/snapper. SNAPper-based functional predictions will soon be offered as part of the PEDANT genome analysis server http://pedant.gsf.de.