六六六（HCH）降解菌Sphingomonas sp. BHC_A的分离与降解特性的研究

从长期受六六六污染的土壤中分离得到一株能以HCH为唯一碳源的高效降解菌株 BHC_A。通过对其主要生理生化特征分析,以及16S rDNA序列的测定和同源性比较分析,将BHC_A鉴定为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）。BHC_A菌株在12h以内能够完全矿化浓度分别为5mg/L的α_、β_、γ_、δ_HCH 4种异构体,特别是对β_HCH的降解在国际上也属少例。而前人所报道的γ_HCH降解菌Sphingomonas paucimobilis UT26菌株对β_HCH和δ_HCH不产生降解作用,即使经过24h的培养,对5mg/L的α_HCH的降解率也只有12.6%。在黄瓜的盆钵试验中发现,15d后BHC_A在土壤中对α、β_、γ_、δ_HCH 4种异构体的降解率为84.3%,能够有效地消除土壤中六六六的污染,缓解植株受药害症状。     

应用RT-qPCR技术定量检测湖泊水体中蓝藻方法的比较

利用RT-qPCR技术建立了对湖泊水体中的微囊藻和蓝藻的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,在所建立的方法中,对以微囊藻藻蓝蛋白基因、蓝藻16S rRNA基因、微囊藻16S rRNA基因分别作为RT-qPCR检测的目的基因所得结果进行了比较,并对实验室培养的微囊藻和太湖的环境样品进行了检测。结果表明,用藻蓝蛋白基因作为检测目的基因,以M.aeruginosa PCC 7806基因组DNA作为标准品的测定方法与显微镜计数的结果有较好的相关性和一致性,并具有简便、快速、特异性高的特点,可以满足检测的要求。     

呋喃丹降解菌CDS-1的双标记菌株的构建

用Sau3AI消化呋喃丹降解菌Sphingomonassp.CDS-1的基因组DNA,将所得DNA片段与BamHⅠ酶切的启动子探针载体pRobe-GFP酶连后转化E.coliDH5α感受态细胞,在选择性平板上培养,从大约1×104个菌落中筛选到50个含启动子片段的阳性克隆。挑选其中一个发光强度最强的阳性克隆F7,将它的重组质粒pF7用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后得到包含Sphingomonassp.CDS-1启动子和gfp基因的DNA片段,将该片段克隆到广宿主载体pPZP201上,得到pPZP201-gfp质粒。将pPZP201-gfp通过三亲接合转移至Sphingomonassp.CDS-1中得到GFP标记菌株CDS-gfp,经荧光显微镜观察,gfp基因在CDS-gfp中表达量很高。对标记菌株进行连续传代10次(48h/次),发现pPZP201-gfp依然存在,而且发光明显。通过NotⅠ酶切位点把linA基因连接到pUT/mini-Tn5上构建新的转座子载体pUT/mini-Tn5-linA。以pRK600为辅助质粒将pUT/mini-Tn5-linA引入到CDS-1中,linA基因通过转座作用,插入到CDS-gfp的染色体中,得到双标记菌株CDS-GFP-LinA。该菌株是一株能同时降解γ-六六六和呋喃丹的基因工程菌,本研究的结果为研究Sphingomonassp.CDS-1的生态学行为奠定了基础。     

遗传稳定型六六六、多菌灵降解基因工程菌构建

通过PCR的方法从六六六降解菌Sphingomonas sp.BHC-A扩增出完整的脱氯化氢酶基因linA.将其克隆到含有mini-Tn5的自杀性质粒pUT4K上,构建成质粒pUT/mini-Tn5-linA.通过三亲杂交,在辅助质粒RK600的帮助下,将pUT/mini-Tn5-linA转移到一株高效降解多菌灵菌株Rhodococcus sp.DJL-6中.利用mini-Tn5的转座作用将linA基因整合到DJL-6的染色体DNA上,得到工程菌株DJL-6A.该工程菌具有同时降解多菌灵和六六六的功能,且对于初始浓度为0.05 μg/mL和5 μg/mL的六六六的降解活性与亲本菌株BHC-A相当.在不加任何选择压力的条件下工程菌株进行连续传代,结果证明linA基因可以持续稳定的存在于宿主的染色体DNA上.     

六六六(HCH)降解菌Sphingomonas sp. BHC-A的分离与降解特性的研究

从长期受六六六污染的土壤中分离得到一株能以HCH为唯一碳源的高效降解菌株BHC-A。通过对其主要生理生化特征分析,以及16S rDNA序列的测定和同源性比较分析,将BHC-A鉴定为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp.)。BHC-A菌株在12h以内能够完全矿化浓度分别为5mg/L的α-、β-、γ-、δ-HCH4种异构体,特别是对β-HCH的降解在国际上也属少例。而前人所报道的γ-HCH降解菌Sphingomonas paucimobilisUT26菌株对β-HCH和δ-HCH不产生降解作用,即使经过24h的培养,对5mg/L的α-HCH的降解率也只有12.6%。在黄瓜的盆钵试验中发现,15d后BHC-A在土壤中对α、β-、γ-、δ-HCH4种异构体的降解率为84.3%,能够有效地消除土壤中六六六的污染,缓解植株受药害症状。     

四环素与3,4-苯并芘复合污染对抗性基因tetA(C)产生高抗性突变的影响

【目的】探究环境中同时存在低浓度四环素(tetracycline,TC)和3,4-苯并芘(benzo [a] pyrene,Bap)对抗性基因tetA(C)产生高抗性突变的影响。【方法】以大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)为宿主菌株,pACYC184质粒作为载体,四环素抗性基因tetA(C)作为研究对象,采用易错PCR构建基因文库的方法,建立基因突变位点对应高抗性的关系密码表。同时设置添加低浓度TC且添加0–30 mg/L Bap以及仅添加0–30 mg/L Bap的处理组,培养携带pACYC184质粒的大肠杆菌14 d,每组中随机挑选10株获得高抗性的菌株,对其中的tetA(C)基因片段进行测序,再结合突变位点密码表,计算高抗性菌株中由基因突变产生高抗性菌株的比例。【结果】测序结果显示在低浓度TC选择压力下,Bap浓度越高时,高抗性基因突变株占的比例也越高(P≤0.01),而不添加TC时,Bap浓度与高抗性基因突变株占比之间无变化规律(P0.05)。【结论】当环境中同时存在Bap和低浓度TC时,高抗性突变基因易于通过选择压力保存下来。     

利用拓扑异构酶II提高转化效率及其在从细菌群落中克隆六六六γ异构体脱氯化氢酶基因中的应用

一个简单的技术上的调整被应用于利用T载体构建的基因组或宏基因组文库策略中。该技术利用拓扑异构酶Ⅱ将超螺旋引入松散的T-A环状重组分子,从而提高转化效率。利用该技术构建一个宏基因组文库,并从中克隆到一个六六六γ异构体脱氯化氢酶基因(linA-like)。     

甲基对硫磷水解酶基因的克隆与融合表达

利用鸟枪法从甲基对硫磷降解菌DLL-1 Peudomonas putida）中克隆了甲基对硫磷水解酶基因(mpd)片段2．5kb,并进行了测序。通过软件分析开放阅读框和启动子序列,表明该序列中最可能为甲基对硫磷水解酶结构基因的阅读框为769—1794区域。软件分析还表明该水解酶前端45个氨基酸为典型的信号肽结构。通过PCR扩增了mpd结构基因,亚克隆到表达载体pET—32a中,构建了完整的融合表达载体pET—MP。转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下2～4h甲基对硫磷水解酶表达可以达到最高水平;同时还研究了乳糖的诱导效果,2％乳糖诱导2h就可以起到很好的效果。通过PCR反应验证了mpd基因定位于DLL-E4的染色体而不是质粒上。     

对硝基苯酚对细菌产生持留菌的影响及其相关机制

【目的】研究对硝基苯酚(PNP)对大肠杆菌和铜绿假单胞菌产生持留菌的影响,并对转录组进行分析,阐明对硝基苯酚影响持留菌形成的相关机制。【方法】采用氧氟沙星抗生素探究对硝基苯酚对细菌产生持留菌的影响,并通过检测细菌自溶情况和呼吸抑制剂羰酰氰氯苯腙(CCCP)对持留菌比例的影响,然后通过转录组分析其相关基因的表达,最后通过实时荧光定量PCR和反义核酸进行相关功能基因的验证。【结果】PNP可以通过抑制大肠杆菌和铜绿假单胞菌的呼吸作用使其产生持留菌的比例增加,PNP不同浓度、作用不同时间和作用不同生长时期的菌体都会影响细菌产生持留菌的比例。PNP和呼吸抑制剂CCCP均能够抑制2个菌体的自溶情况,包括溶解氧含量的变化、蛋白质降解情况、细胞尺寸的变化和RNA完整性。转录组分析和实时荧光定量PCR实验结果表明加入PNP后,cyo A、app C两个基因在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中的表达量均显著下降,再通过反义核酸抑制cyo A、app C的表达发现持留菌的比例和原始菌株相比均有所增加。【结论】PNP可以通过抑制细胞呼吸作用来增加细菌产生持留菌的比例。