Kozak序列+4G提高绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达

构建含不同Kozak序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因真核表达载体, 并检测它们在HEK293细胞中的表达差异。 通过设计突变的PCR引物改变目的基因GFP的Kozak序列, +4 位碱基分别为A和G, 且不改变氨基酸编码, 将PCR扩增的GFP片段与载体pcDNA3.1进行酶切、连接、转化、鉴定。成功构建的pHGFP-A, pHGFP-G质粒采用脂质体法转染HEK293细胞, 荧光显微镜下观察绿色荧光表达, 流式细胞术检测目的蛋白GFP的荧光表达阳性率, Western blot检测目的蛋白GFP的表达。构建的两质粒均能有效转染 HEK293细胞, 其中流式细胞术分析显示: pHGFP-A组GFP阳性率约为15%, pHGFP-G组GFP阳性率约为45%; Western blot 显示pHGFP-G的GFP表达量约为pHGFP-A的GFP表达量3.87倍。结果表明, Kozak序列+4G(?3位为嘌呤碱基时)在蛋白表达中发挥重要作用, 可以使绿色荧光蛋白GFP在HEK293细胞中的表达量提高约4倍。     

用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告分子筛选有效的siRNA

 建立一种利用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告分子筛选能有效抑制目的基因表达的siRNA的方法.以巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因为研究对象,筛选能有效沉默MIF表达的质粒载体介导的siRNA.构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的MIF-GFP融合表达载体pEGFP-MIF.分别将3个靶向MIF的siRNA表达质粒与pEGFP-MIF共转化HEK293细胞,在荧光显微镜下观察HEK293细胞中GFP的表达,并用荧光定量PCR检测HEK293细胞中MIF mRNA的表达水平.同时,将MIF siRNA表达质粒分别与MIF表达载体共转化HEK293细胞,用荧光定量PCR检测HEK293细胞中MIF mRNA的表达水平.定量PCR结果显示,GFP表达低的细胞中,MIF mRNA的表达也明显降低;利用pEGFP-MIF和MIF表达载体筛选到的有效MIF siRNA的结果一致.因此,建立了目的基因与GFP融合表达,以GFP作为报告分子来筛选抑制目的基因表达siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案.     

hTEM8-N-RFP融合蛋白真核表达载体的构建及在HEK293F细胞中表达

目的:构建人肿瘤内皮标志物8(hTEM8)胞外区(N端)与红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体并在HEK293F细胞中表达,为进一步研究hTEM8的相互作用蛋白及其在肿瘤血管形成过程中的机制奠定实验基础。方法:以质粒pDsRed-Express-C1和重组质粒pcDNA3.1(+)-hTEM8/Fc为模板,PCR扩增RFP和hTEM8-N基因片段,先后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP,转染HEK293F细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白在转染细胞中的的表达,并用G418对转染的细胞进行加压筛选,Western blot检测hTEM8-N-RFP融合蛋白在转染细胞中的表达。结果:DNA测序、酶切鉴定的结果显示,表达载体pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP构建成功,且序列正确。转染后经荧光显微镜观察到HEK293F细胞中有红色荧光,经加压筛选单克隆后,在荧光显微镜下观察到稳定表达红色荧光的细胞株,Western blot检测到融合蛋白hTEM8-N-RFP在真核细胞HEK293F中获得表达。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP真核表达载体,并在HEK293F细胞中表达,为后期研究hTEM8的相互作用蛋白和其生理功能奠定了良好的基础。     

Kozak序列(+4G)对携带EGFP标签的人淀粉样前体蛋白751在CHO细胞中表达的影响

目的:观察Kozak序列(+4G)对稳定转染的人淀粉样前体蛋白(hAPP751)-EGFP融合真核表达载体在CHO细胞中表达的影响,为APP的水解代谢研究提供细胞模型。方法:分别将含Kozak序列(+4G)和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段亚克隆入pEGFP-N1表达载体,得到pEGFP-hAPP751(+4G)和pEGFP-hAPP751重组质粒,转染CHO细胞,通过G418筛选稳定转染细胞株,再用倒置荧光显微镜挑取绿色荧光强的细胞进行亚克隆,并观察融合蛋白的表达强度和细胞定位,最后用EGFP抗体通过Western印迹检测融合蛋白。结果:PCR、酶切和测序证明将含Kozak序列(+4G)和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段分别连入了真核表达载体pEGFP-N1中;荧光显微镜下观察pEGFP-hAPP751(+4G)稳定转染细胞的细胞膜和细胞质产生较强的绿色荧光,其中在细胞质中成不均匀颗粒状分布,Western印迹检测到相对分子质量约156 000的融合表达蛋白,与预期相符;pEGFP-hAPP751转染细胞,其绿色荧光十分微弱且在整个细胞均匀分布,Western印迹检测到相对分子质量约26 000的EGFP,但检测不到预期的hAPP751-EGFP融合表达蛋白。结论:Kozak序列(+4G)可以明显促进hAPP751的表达,获得稳定转染且高水平融合表达hAPP751-EGFP的细胞株。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

稳定表达重组小鼠FAPα蛋白细胞株的构建

采用RT-PCR方法从BALB/c胚鼠成纤维细胞克隆FAPα基因,将其连接至表达栽体pTd-FL-N,转化Stbl3感受态.筛选重组质粒,经酶切、PCR检测及测序鉴定,证实表达质粒构建正确.将表达载体转染HEK293细胞,经G418筛选单克隆阳性细胞,采用Western blot技术证实稳定表达FAPα细胞株构建成功.通过流式细胞术确定FAPa蛋白可定位表达于细胞膜上.     

人类ZNF434基因的克隆、真核表达和组织表达谱分析

目的:克隆人类ZNF434基因并构建其真核表达质粒,鉴定ZNF434基因的组织表达谱。方法:实时定量PCR检测ZNF434基因在人体10种组织中的表达情况;克隆ZNF434基因的全长开放读码框区并连入真核表达载体pIRES2-EGFP,磷酸钙沉淀法转染HEK293T细胞,荧光显微镜和Western blot鉴定ZNF434蛋白的表达情况。结果:ZNF434基因在检测的人体组织中均有表达,其中骨髓和睾丸表达最高,成功克隆了ZNF434基因并构建了该基因的真核表达质粒ZNF434-pIRES2-EGFP,转染HEK293T细胞可观察到绿色荧光蛋白表达,Western blot可检测出分子量56kDa的Flag-ZNF434融合蛋白表达。结论:明确了人类ZNF434基因的组织表达谱,构建了该基因的真核表达载体,为该基因的进一步研究奠定了基础。     

信号肽序列对禽流感病毒H5N1 HA 蛋白GFP融合分子在真核细胞中表达的影响

[目的]构建绿色荧光蛋白(GFP)与禽流感病毒(AIV)HA基因的融合表达载体,观察信号肽序列的有无及位置对HA-GFP在293T细胞中的表达影响.[方法]应用PCR方法从H5N1亚型AIV质粒DNA中扩增出完整的或除去信号肽序列的HA基因片段,PCR产物经Xho Ⅰ和SmaⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的不同位点,将得到的重组体M1,M2和M3分别转化宿主菌DH5a,经双酶切及.DNA测序鉴定分析后,采用脂质体转染法将pEGFF-C1,M1,M2和M3转染人胚肾细胞系293T细胞,荧光显微镜下观察HA-GFP的表达,流式细胞仪检测表达HA蛋白的细胞百分数.[结果]经酶切及测序鉴定成功构建了HA-GFP重组表达载体M1,M2和M3,荧光显微镜及流式细胞仪检测到重组质粒转染的293T细胞表达强的荧光蛋白,信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达有显著影响,信号肽序列使HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达减少,而信号肽的位置对融合蛋白表达量的影响不显著.[结论]信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在细胞中的表达有显著影响.     

Mpl与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的:探索Mpl与绿色荧光蛋白GFP基因共同转粢哺乳动物细胞NIH3T3的方法.方法:采用PCR方法将GFP基因与Mpl基因构建融合荧光蛋白的真核表达载体,用脂质体介导转染NIH3T3细胞和筛选稳定细胞系,使用荧光显微镜方法和Westernblotting检测转染效果.结果:利用PCR方法有效扩增了Mpl基因,构建了融合荧光蛋白的真核表达载体,序列分析表明所构建的含Mpl基因的质粒与设计相同,使用荧光显微镜方法和Western blotting检测Mpl融合绿色荧光蛋白表达载体成功转染NIH3T3细胞.结论:成功构建了Mpl荧光表达载体,融合基因可以在NIH3T3细胞中稳定表达,为进一步研究Mpl的生物学活性及其与hNUDC蛋白相互作用提供了重要的理论依据.     

人HCN2真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的：构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞（HEK293）中的表达情况。方法：对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切（XhoI和BamHI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果：测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论：成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。     

反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的表达

目的:利用反转录病毒载体构建猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白(APOBEC)3F重组质粒,并实现其在猪肾细胞PK15中的表达。方法:用RT-PCR方法扩增五指山猪来源的外周血淋巴细胞APOBEC3F基因,将其定点插入反转录病毒载体pMSCV neo中,同时于插入位点两侧分别添加FLAG和GFP标签,构建重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的重组质粒与pVSV-G、pGag-Pol共转染包装细胞HEK293T,分别于转染后48~72 h收集细胞的培养上清以获得假型病毒粒子;用该假型病毒感染猪源细胞PK15,通过PCR、Western印迹检测目的基因的整合及表达。结果:PCR扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP经酶切、测序,结果无误;3质粒共转染HEK293T细胞包装出的假型病毒感染PK15细胞后观察到GFP表达;从感染假型病毒的PK15细胞基因组中扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,Western印迹检测到78.1×103的猪APOBEC3F蛋白的表达。结论:实现了反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的整合与表达,为深入研究该分子对猪内源性反转录病毒(PERV)的抑制作用奠定了基础。     

Use of short-lived green fluorescent protein for the detection of proteasome inhibition

Human embryonic kidney (HEK293) cells were stably transduced with a retroviral vector containing an expression cassette for a short-lived green fluorescent protein (d2EGFP) and the neomycin resistance gene (Neor). When Neor HEK293 clones were treated with proteasome inhibitors, lactacystin or MG132, an increase in the constitutive levels of d2EGFP expression was observed. Based on flow cytometry, proteasome inhibitors induced a 5- to 10-fold increase in the fluorescent intensity of d2EGFP in HEK293 cell clones. However, in the presence of proteasome inhibitors, HEK293 clones showed a 4- to 6.5-fold increase in d2EGFP concentration as determined by western blot analysis. Our data suggest that d2EGFP is a useful indicator of proteasome inhibition. Therefore, stable expression of d2EGFP in mammalian cells is potentially useful for high-throughput screening of cDNAs or pharmaceutical drugs that repress proteasome functions in vivo.     

SOCS3基因重组腺病毒的构建及其在猪脂肪细胞中的表达

本研究旨在构建细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的重组腺病毒表达载体,获得有感染性的病毒颗粒。以pcDNA3-SOCS3质粒为模板扩增SOCS3基因,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经测序验证后,重组的穿梭质粒用PmeI酶切线性化后转化到BJ5183感受态细菌中与其内的骨架载体pAdEasy-1进行同源重组,获得的重组质粒pAd-SOCS3,经PacI线性化后转染至HEK293细胞中进行包装和扩增,纯化后用TCID50法测定病毒滴度。以重组的病毒感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3 mRNA和蛋白的表达。重组腺病毒载体pAd-SOCS3经酶切及PCR鉴定正确,病毒滴度为1.2×109PFU/mL;感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜观察可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western blotting检测到细胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表达显著提高。本研究成功构建了SOCS3基因的重组腺病毒,感染原代培养的猪脂肪细胞可稳定表达SOCS3蛋白,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础。     

SCG10基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建SCG10真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库为模板,PCR扩增SCG10全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚肾HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-SCG10在HEK293细胞内定位。结果 SCG10全长基因序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小540bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为48kD。pEGFP-SCG10在细胞内定位以细胞浆为主,在细胞核少量表达。结论成功构建了SCG10全长基因真核表达载体,pEGFP-SCG10蛋白主要定位于HEK293细胞浆内。