人工miRNA沉默基因的研究

人工miRNA(amiRNA)是一种高效的基因沉默技术,其原理是以植物内源miRNA的前体为基本骨架,将其茎环结构中的miRNA/miRNA*序列替换为amiRNA/amiRNA*序列,使产生的amiRNA作用于目标靶基因,以实现对靶基因表达的抑制。以拟南芥中转录因子基因MYB28为例,介绍了amiRNA的设计基本原理和构建方法。在MYB28基因序列的3'端、5'端和中间部分分别设计了amiRNA,以拟南芥内源的miRNA 319a前体为骨架,以靶向于MYB28的amiRNA序列替代原有的miRNA 319a序列,在拟南芥中过量表达,获得的转基因植株中MYB28表达水平平均降低了86%。根据试验结果对人工miRNA沉默基因技术的特点及应用前景进行了讨论。     

毛竹miR164b前体的克隆及其在叶形态建成中的功能分析

microRNA（miRNA）参与植物多种生理代谢过程,在调控植物形态建成中发挥着重要作用。miR164作为植物特有的miRNA,其主要的靶基因是NAC转录因子,参与调控植物茎、叶顶端分生组织的建立、器官的分化和植株衰老等过程。本研究以毛竹（Phyllostachys edulis（Carr.） Lehaie）为材料,从中分离出miR164b的前体序列（82 bp）,二级结构分析结果发现该前体序列能够形成稳定的茎环结构,其成熟序列（21 bp）产生于茎环结构5'端的臂上,且碱基具有较高的保守性。本研究还构建了由CaMV 35S启动,包含毛竹miR164b前体序列的植物表达载体,并转化野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.） Heynh）,获得了转基因植株。结果表明,转基因植株生长瘦弱,莲座叶数量明显减少,叶片变小且叶片边缘锯齿减少,更加光滑。实时定量PCR分析结果显示,转基因拟南芥中毛竹miR164b的表达量极显著上升,而拟南芥内源靶基因CUC1与CUC2的表达量极显著下降。表明毛竹miR164b通过调节CUC1和CUC2的表达来参与植物叶形态建成过程。研究结果可为利用miRNA开展竹子分子育种提供参考。     

拟南芥热激转录因子耐高温功能分析

从拟南芥基因组中克隆了热激转录因子(At Hsf A6a),构建了过量表达(over-expression,OE)和反义(anti-sense,AS)植物表达载体并转化拟南芥,获得了拟南芥纯合转基因株系。对其进行耐高温处理,结果显示:43℃处理2 h,过量表达转基因植株存活率(86%)远高于野生型(59%);而反义转基因植株存活率则只有43%,显著低于野生型。43℃处理0.5 h,过量表达转基因植株的离子渗漏水平显著低于野生型,而反义转基因植株则大幅度升高。基因表达分析证明,AtHsfA6a的表达受热胁迫诱导,并且Hsp70是受AtHsfA6a调控的下游靶基因。上述结果表明,拟南芥AtHsfA6a可能通过调节Hsp70表达,提高植物耐受高温胁迫的能力。     

山葡萄CBF基因表达载体构建及对拟南芥根生长的影响

为了研究山葡萄CBF基因调节植物对盐胁迫的应答机理,分别构建了山葡萄Va CBF1、Va CBF2和Va CBF3的植物过表达载体。经酶切及琼脂糖电泳检测证实3个基因均插入到p BASTA中,表明表达载体构建成功。然后,分别将3个植物过表达载体转入农杆菌EHA105中,并通过浸花法浸染拟南芥。利用除草剂筛选获得3个基因的拟南芥过表达株系。最后,对野生型拟南芥与转基因拟南芥进行盐胁迫处理,发现OE-CBF2转基因植株的主根伸长长度显著长于其它植株,3个转基因株系的侧根长度也明显长于野生型植株。上述结果表明山葡萄CBF基因可能在植物盐胁迫中对根部生长发育起到非常重要的调控作用。     

转甜瓜CmSAMDC基因拟南芥的获得及其耐盐性研究

该研究以哥伦比亚生态型野生拟南芥为材料,将甜瓜CmSAMDC基因构建到植物双元表达载体pCAMBIA1304上,采用农杆菌介导法转入拟南芥,在含有50mg/L潮霉素(Hyg)MS固体培养基上筛选转基因后代,并利用T3代转基因幼苗进行耐盐性分析。结果显示:(1)成功构建了植物超表达载体35S∷CmSAMDC,并经农杆菌介导法转化拟南芥,潮霉素抗性筛选后获得了转CmSAMDC基因拟南芥T3代植株。(2)转CmSAMDC基因拟南芥T3代幼苗在含100、150、200mmol/L NaCl培养基中,侧根长势比野生型植株更为健壮;在200mmol/L NaCl浇灌处理后,转CmSAMDC基因T3代植株仍能维持正常生长,而野生型植株的生长明显受到抑制;在400mmol/L NaCl浇灌处理后16d,野生型植株逐渐死亡,而转基因植株仍能继续存活;对盐胁迫后植株的脂质过氧化程度(MDA)测定显示,野生型植株MDA水平较转基因植株上升更为明显。研究表明,过表达甜瓜CmSAMDC基因增强了转基因拟南芥的耐盐性。     

盐穗木miRNA417的克隆及对种子萌发和幼苗成活率的影响

MicroRNA (miRNA)是植物重要的基因表达调控因子,miR417的表达受盐胁迫的调节,高盐胁迫时,拟南芥miR417的表达能够抑制种子的萌发和幼苗成活。本研究通过分析miRbase数据库中已知植物miRNA417的序列,利用PCR技术成功克隆获得了盐生植物盐穗木的miR417（HcmiR417）的前体序列,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301上,通过花絮浸染法对拟南芥进行遗传转化。结果表明,在150 mmol·L^-1 NaCl的胁迫下,分别过表达HcmiR417和过表达拟南芥miRNA417（AtmiR417）的转基因拟南芥种子的萌发率和幼苗存活率均较野生型低,但两种转基因拟南芥株系之间没有差异。初步验证了盐生植物HcmiR417在种子萌发和幼苗成活率方面也具有负调控作用,盐生植物盐穗木和拟南芥植物miRNA在功能没有显示出差异。     

拟南芥PR-1基因启动子的克隆与植物表达载体的构建

根据已报道的拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）病程相关蛋白基因（PR-1）序列设计引物,通过PCR技术从拟南芥中扩增得到水杨酸诱导表达的PR-1基因启动子片段,序列分析表明,该启动子含910bp核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99．7％：将该启动子构建到植物表达载体pB1121上,获得病程相关蛋白基因（PR-1）启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体pBI-prlp,将其转入根癌农杆菌GV3101,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,为深入研究寄主-病原物相互作用的分子机理奠定基础。     

大豆转录因子GmC2H2基因转化拟南芥效果分析

GmC2H2转录因子基因是本实验室获得的一个编码172个氨基酸携带516bp核苷酸的转录因子,属于经典C2H2型锌指蛋白.通过构建植物表达载体GmC2H2-pCAMBIA1304,借助优化的Floral-dip法转化模式植物拟南芥,经潮霉素Hygromycine( 45-50 mg/L)抗性筛选获得转基因拟南芥植株.GUS组织染色分析表明,GmC2H2基因在生长12d的转基因拟南芥幼苗中,表达部位主要集中在根部.对转基因拟南芥进行了低温(1℃)和脱落酸(200 μmol/L)胁迫处理,测定其生理生化指标,通过real-time qPCR确定目的基因在转基因拟南芥中的表达情况.结果表明,携带GmC2H2目的基因的转基因拟南芥中脯氨酸和可溶性糖水平要高于野生型植株,而丙二醛水平要低于野生型,在抗逆性方面明显优于野生型拟南芥植株;并且胁迫处理下的转基因拟南芥中GmC2H2基因的表达量要高于未胁迫处理的转基因植株,说明GmC2H2基因的表达受低温和ABA的诱导,初步明确了该转录因子基因的功能.     

Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因转化马铃薯的研究

为获得抗旱性强、生长正常的转基因马铃薯植株,以野生拟南芥生态型(Col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆了拟南芥Rd29A(responsive to dehydration)基因ATG上游+83bp至-1 441bp共1 524bp的启动子区域,其DNA序列与已知拟南芥Rd29A 5'端启动子序列同源性为100%;构建了Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的植物表达载体pCHFRd-CDPK1。以马铃薯品种‘费乌瑞它’的试管微型薯为材料,利用农杆菌介导法,将构建成功的pCHFRd-CDPK1载体转入马铃薯中,经筛选与植株再生,获得抗性再生植株。通过PCR和Southern blot检测显示,Rd29A启动子驱动的AtCDPK1基因已整合在马铃薯的基因组中。利用PEG模拟干旱胁迫后,经RT-PCR分析证实,当用20%的PEG胁迫转基因马铃薯植株时,Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的转基因马铃薯各个株系中AtCDPK1基因表达量明显增强,而在无胁迫的条件下,植株中AtCDPK1基因基本不表达;同时发现35S控制AtCDPK1转基因植株在PEG胁迫前后,基因转录未见明显差异。形态学观察还表明,在30%PEG胁迫下,转基因植株能正常生长,其长势优于未转基因的对照,且对照植株略有萎焉。该结果可为进一步利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在农作物中的表达研究及其遗传改良提供依据。     

人工microRNAs对拟南芥At1g13770和At2g23470基因的特异沉默

DUF647 (Domain of unknown function 647) 蛋白家族是在真核生物中广泛存在的、高度保守的蛋白家族。拟南芥中该基因家族共有6个成员, 迄今为止拟南芥DUF647家族中4个成员的功能尚不清楚。文章以拟南芥内源MIR319a前体为骨架, 构建了敲减DUF647家族中2个基因At1g13770和At2g23470表达的人工microRNAs(Artifical microRNAs, amiRNAs)。利用WMD(Web microRNA designer)平台设计分别靶向At1g13770和At2g23470基因的amiRNAs序列, 通过重叠PCR置换拟南芥MIR319a前体序列。构建融合amiRNAs前体的植物表达载体pCHF3-amiRNAs, 在农杆菌介导下转化拟南芥。RT-PCR分析表明, amiRNAs能够显著抑制At1g13770和At2g23470基因的表达, 获得了抑制效果明显的转基因株系。At2g23470-amiRNA转基因植株At2g23470转录水平的下调导致育性严重下降。文章为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。     

人工microRNAs对拟南芥At1g13770和At2g23470基因的特异沉默

DUF647(Domain of unknown function 647)蛋白家族是在真核生物中广泛存在的、高度保守的蛋白家族。拟南芥中该基因家族共有6个成员,迄今为止拟南芥DUF647家族中4个成员的功能尚不清楚。文章以拟南芥内源MIR319a前体为骨架,构建了敲减DUF647家族中2个基因At1g13770和At2g23470表达的人工microRNAs(Artifical microRNAs,amiRNAs)。利用WMD(Web microRNA designer)平台设计分别靶向At1g13770和At2g23470基因的amiRNAs序列,通过重叠PCR置换拟南芥MIR319a前体序列。构建融合amiRNAs前体的植物表达载体pCHF3-amiRNAs,在农杆菌介导下转化拟南芥。RT-PCR分析表明,amiRNAs能够显著抑制At1g13770和At2g23470基因的表达,获得了抑制效果明显的转基因株系。At2g23470-amiRNA转基因植株At2g23470转录水平的下调导致育性严重下降。文章为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。     

荠菜CRABS CLAW的克隆与拟南芥遗传转化

根据GenBank收录的CRC基因cDNA序列设计引物,以短角果荠菜(Capsella bursa-pastoris)为材料,通过RT-PCR扩增出与拟南芥CRC基因同源的全长cDNA,进行测序、比对及同源性分析.结果显示,克隆的该基因cDNA序列与报道的拟南芥CRC序列一致性达到93%,可以推断其为荠菜CRC基因的cDNA(cbCRC).以Ti质粒pWM101为载体,构建了由CaMV35S启动子调控的cbCRC基因植物表达载体pWM101-cbCRC, 采用根癌农杆菌滴注柱头法转化拟南芥,获得了转cbCRC基因的拟南芥植株.转基因拟南芥心皮果荚形态大小发生了一定的变化,说明荠菜cbCRC基因在拟南芥中的表达对拟南芥心皮形态和大小都产生了一定影响,但其并没有使拟南芥表现出荠菜短角果的形态.     

拟南芥AtVQ29基因的克隆与植物表达载体构建

目的:VQ模序蛋白是植物中所特有的一类具有高度保守序列的蛋白质,广泛参与植物的生长发育与逆境反应,本研究拟克隆拟南芥的AtVQ29基因并进一步构建由组成型启动子CaMV 35S驱动的植物表达载体pSN1301-AtVQ29。方法:采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA,根据已报道的AtVQ29基因序列设计并合成引物,通过PCR技术扩增获得拟南芥AtVQ29基因,经T载体克隆后测序。利用生物信息学软件对序列进行初步分析,同时基于基因重组技术构建植物表达载体。结果:序列分析表明已成功克隆AtVQ29基因,该基因编码区全长为372bp,共编码123个氨基酸残基,具有保守的VQ模序。并进一步构建了由组成型启动子CaMV 35S驱动的AtVQ29基因植物表达载体pSN1301-AtVQ29。结论:本研究所构建的AtVQ29基因植物表达载体能够在转基因植株中过量表达AtVQ29基因,为后期开展基因功能研究与植物基因改良奠定了基础。     

马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证

马铃薯块茎的形成涉及一系列基因的表达和关闭。以马铃薯普通栽培品种"大西洋"为试验材料,采用RT-PCR扩增获得马铃薯STI-LIKE基因全长片段。RT-PCR定量分析表明,该基因在马铃薯营养器官中均有表达。生物信息学分析表明STI-LIKE蛋白具有3个TPR结构域,在高等植物中具有高同源性,是一个普遍存在的蛋白质。为验证STI-LIKE蛋白在拟南芥植株发育中功能,分别构建该基因强启动子表达载体(p BI121)和干扰载体(p HANNIBAL和p ART27),转化拟南芥获得了两种载体的拟南芥转基因植株,同时制备STI-LIKE蛋白抗体验证转基因植株蛋白表达。研究结果表明STI-LIKE基因可能参与拟南芥株型发育过程。     

人工microRNA干扰拟南芥AtCDKC;1和AtCDKC;2基因表达的初步研究

以来源于拟南芥的microRNA序列为骨架,构建抑制AtCDKC;1和AtCDKC;2基因的人工microRNAs载体,研究其对目的基因表达的抑制效果。选择AtCDKCs基因的特异性序列,通过重叠PCR的方法改造拟南芥microRNA164a骨架序列,连接到双元载体pPZPY122,在农杆菌介导下转化拟南芥。RT-PCR分析表明,人工microRNA能够显著抑制目的基因的表达,获得了抑制效果明显的转基因植株,并且对AtCDKCs在拟南芥生长发育中的作用进行了初步的研究。     

厚藤脱水素基因IpDHN启动子IpDHN-Pro的克隆和调控转录活性分析

为了解厚藤(Ipomoea pes-caprae)脱水素基因IpDHN (GenBank登录号:KX426069)启动子的转录活性和对非生物胁迫和植物激素ABA的响应,通过染色体步移法克隆了IpDHN的上游启动子序列IpDHN-Pro,长度为974 bp。构建IpDHN-Pro调控下GUS转基因载体,转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株获得IpDHN-Pro::GUS转基因植株并进行GUS染色,验证IpDHN-Pro启动转录活性以及在氯化钠、甘露醇、ABA处理后拟南芥GUS基因表达变化。结果表明,扩增获得的IpDHN-Pro序列包含多个顺式作用元件,包括1个ABRE、3个Myb转录因子结合位点、富含TC的重复序列以及Skn-1基序等。转基因拟南芥GUS染色及qRT-PCR表明该序列可驱动GUS基因在拟南芥稳定表达,且表达受高盐、渗透压及ABA的诱导。这表明IpDHN-Pro是一个盐旱、ABA诱导的启动子序列,可应用于相关的植物抗逆遗传工程研究。     

棉花乙烯合成基因促进拟南芥和烟草不定根发生的研究

从棉花纤维cDNA中克隆获得乙烯合成基因GhACO3,构建了植物过量表达载体p35S::GhACO3.通过花序侵染法和叶盘法分别转化拟南芥和烟草,利用卡那霉素筛选及分子检测获得转基因阳性拟南芥和烟草植株.结果表明,GhACO3基因已整合到拟南芥和烟草基因组中;经过纯合筛选后获得转基因T2代拟南芥植株;与野生型拟南芥相比,GhACO3基因对拟南芥不定根发生具有显著促进作用;与野生型烟草植株相比,转GhACO3基因烟草不定根发生得到了显著的促进.研究表明,GhACO3基因的过量表达能够促进拟南芥和烟草不定根的形成发育,为进一步探讨GhACO3的生物学功能和进行转基因育种奠定了基础.     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控。构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)植物和水稻(OryzasativaL.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因。转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高。这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达。在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节。     

小麦耐逆基因-TaLEA2转化拟南芥的研究

研究小麦第3组LEA基因中T aLEA2对耐旱和耐盐性能的影响.将小麦第3组LEA基因T aLEA2连接在双元表达载体pB I121 C aM V 35S启动子下游,构建了能在植物中高效表达的载体pB I121-T aLEA2.通过农杆菌介导的真空渗透法,将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证,获得T0代转基因植株,并用不同浓度的PEG 4000和N aC l对转基因拟南芥的耐逆性进行检测.结果表明,这些转基因植株可明显改进拟南芥在10%PEG及0.8%N aC l培养基上的生长状态.在实验条件下,转基因拟南芥的耐旱性及耐盐性均有所提高,提示T aLEA2基因在植物水分调节方面有重要作用.     

拟南芥GH3.9基因的过表达及其表型分析

为研究GH3.9基因在植物生长发育过程中的作用,利用RT-PCR成功克隆到GH3.9基因,该基因全长为1 750bp。通过构建pEGAD-GH3.9过表达载体转化拟南芥,获得过表达GH3.9基因纯系转基因株系GH3.9ox-3和GH3.9ox-7。对拟南芥野生型(WT)和转基因株系(GH3.9ox-3和GH3.9ox-7)幼苗用不同光强和光质进行处理,结果显示:在蓝光、红光、远红光等不同光照强度下培养,过表达株系幼苗下胚轴的生长均明显受到抑制,且较野生型明显;采用不同光周期处理拟南芥幼苗,过表达幼苗下胚轴的伸长明显低于野生型;对成年植株表型进行观察,发现过表达株系植株矮小、雄蕊变短、果荚短小。研究表明:GH3.9基因参与了拟南芥生长发育调控,过表达GH3.9基因对拟南芥生长有抑制作用。