拟南芥At5g01510和At5g49820基因人工microRNAs的构建与鉴定

以拟南芥内源MIR319a前体为骨架,构建沉默DUF647家族基因At5t01510和At5g49820表达的人工microRNAs,研究其对目的基因表达的抑制效果。利用WMD平台设计分别靶向At5g01510和At5g49820的amiRNAs序列,通过重叠PCR改造拟南芥MIR319a骨架序列,使其包含我们设计的特异amiRNAs序列。构建35S：：amiR-At5g0150和35S：：amiR-At5g49820融合基因,以农杆菌介导的花苞浸染法转化获得转基因拟南芥。RT-PCR分析表明,人工microRNAs能够显著抑制靶基因的表达,获得了抑制效果明显的转基因植株。本工作为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。     

人工microRNAs对拟南芥At1g13770和At2g23470基因的特异沉默

DUF647 (Domain of unknown function 647) 蛋白家族是在真核生物中广泛存在的、高度保守的蛋白家族。拟南芥中该基因家族共有6个成员, 迄今为止拟南芥DUF647家族中4个成员的功能尚不清楚。文章以拟南芥内源MIR319a前体为骨架, 构建了敲减DUF647家族中2个基因At1g13770和At2g23470表达的人工microRNAs(Artifical microRNAs, amiRNAs)。利用WMD(Web microRNA designer)平台设计分别靶向At1g13770和At2g23470基因的amiRNAs序列, 通过重叠PCR置换拟南芥MIR319a前体序列。构建融合amiRNAs前体的植物表达载体pCHF3-amiRNAs, 在农杆菌介导下转化拟南芥。RT-PCR分析表明, amiRNAs能够显著抑制At1g13770和At2g23470基因的表达, 获得了抑制效果明显的转基因株系。At2g23470-amiRNA转基因植株At2g23470转录水平的下调导致育性严重下降。文章为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。     

人工microRNAs对拟南芥At1g13770和At2g23470基因的特异沉默

DUF647(Domain of unknown function 647)蛋白家族是在真核生物中广泛存在的、高度保守的蛋白家族。拟南芥中该基因家族共有6个成员,迄今为止拟南芥DUF647家族中4个成员的功能尚不清楚。文章以拟南芥内源MIR319a前体为骨架,构建了敲减DUF647家族中2个基因At1g13770和At2g23470表达的人工microRNAs(Artifical microRNAs,amiRNAs)。利用WMD(Web microRNA designer)平台设计分别靶向At1g13770和At2g23470基因的amiRNAs序列,通过重叠PCR置换拟南芥MIR319a前体序列。构建融合amiRNAs前体的植物表达载体pCHF3-amiRNAs,在农杆菌介导下转化拟南芥。RT-PCR分析表明,amiRNAs能够显著抑制At1g13770和At2g23470基因的表达,获得了抑制效果明显的转基因株系。At2g23470-amiRNA转基因植株At2g23470转录水平的下调导致育性严重下降。文章为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。     

人工miRNA沉默基因的研究

人工miRNA(amiRNA)是一种高效的基因沉默技术,其原理是以植物内源miRNA的前体为基本骨架,将其茎环结构中的miRNA/miRNA*序列替换为amiRNA/amiRNA*序列,使产生的amiRNA作用于目标靶基因,以实现对靶基因表达的抑制。以拟南芥中转录因子基因MYB28为例,介绍了amiRNA的设计基本原理和构建方法。在MYB28基因序列的3'端、5'端和中间部分分别设计了amiRNA,以拟南芥内源的miRNA 319a前体为骨架,以靶向于MYB28的amiRNA序列替代原有的miRNA 319a序列,在拟南芥中过量表达,获得的转基因植株中MYB28表达水平平均降低了86%。根据试验结果对人工miRNA沉默基因技术的特点及应用前景进行了讨论。     

利用人工microRNA实现基因沉默

MicroRNA是一组长度约为21 nt的非编码蛋白质的短序列RNA,能通过碱基互补配对的方式指导降解靶基因mRNA或抑制靶基因的翻译。MicroRNA的主要功能是调控基因的表达,在生物体的生长、发育及疾病发生中扮演着重要的角色。本文介绍了利用microRNA实现基因沉默的作用原理,人工合成microRNA,构建转基因载体,实现对目的基因的沉默及这种工具在生命科学领域的应用前景。     

用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用

目的:构建用于鉴定microRNA靶基因的报告基因系统。方法:在pGL3-Basic载体的luc基因上游插入CMV启动子,下游插入用于克隆靶基因3’UTR的多克隆位点,构建报告基因载体pMIR-luciferase;将pMIR-lu-ciferase载体的luc基因替换成Rluc基因,构建内参载体pMIR-control;将补体因子H(CFH)的3’UTR插入pMIR-luciferase载体的多克隆位点处,构建含有CFH 3’UTR的报告基因载体;用pIRES2-EGFP载体构建microRNA146a真核表达载体;将含有CFH 3’UTR的报告基因载体、microRNA146a真核表达载体及内参载体共转染HepG2细胞,进行报告基因的活性检测。结果:构建了报告基因载体、内参载体和microRNA146a真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确;microRNA146a真核表达载体转染细胞72 h后,经荧光显微镜观察确认载体转染及表达;用实时定量PCR检测,microRNA146a的表达水平显著上调(P<0.01);用构建的报告基因系统检测,结果表明microRNA146a显著地抑制了含CFH 3’UTR的报告基因的活性(P<0.05)。结论:构建了一种新型的报告基因载体系统,该系统可用于miRNA靶基因的鉴定。     

荠菜CRABS CLAW的克隆与拟南芥遗传转化

根据GenBank收录的CRC基因cDNA序列设计引物,以短角果荠菜(Capsella bursa-pastoris)为材料,通过RT-PCR扩增出与拟南芥CRC基因同源的全长cDNA,进行测序、比对及同源性分析.结果显示,克隆的该基因cDNA序列与报道的拟南芥CRC序列一致性达到93%,可以推断其为荠菜CRC基因的cDNA(cbCRC).以Ti质粒pWM101为载体,构建了由CaMV35S启动子调控的cbCRC基因植物表达载体pWM101-cbCRC, 采用根癌农杆菌滴注柱头法转化拟南芥,获得了转cbCRC基因的拟南芥植株.转基因拟南芥心皮果荚形态大小发生了一定的变化,说明荠菜cbCRC基因在拟南芥中的表达对拟南芥心皮形态和大小都产生了一定影响,但其并没有使拟南芥表现出荠菜短角果的形态.     

转基因植物中载体骨架序列的安全性隐患及解决方案

载体骨架序列等非目的基因外源DNA片段整合入植物染色体中有可能引发的安全性问题已成为近年来植物基因工程研究的热点之一。总结了载体骨架序列整合进植物染色体的现象、由此引发的安全性隐患和机理 ,以及解决该问题的研究思路和方法 ,并着重介绍了采用基本元件转化植物的研究进展。     

沉默VHA-c4基因对拟南芥根长和种子萌发的影响

为了研究植物液泡H+-ATPase c亚基VHA-c4基因在拟南芥响应非生物胁迫中的作用,本研究构建了拟南芥VHA-c4基因沉默载体,利用农杆菌介导,将线性化的沉默载体dsDNA片段整合在拟南芥基因组上,筛选获得了能够不同程度特异沉默VHA-c4基因的7个转基因株系c4-1～c4-7,并对VHA-c4基因沉默效果最好的株系c4-2进行NaCl、ABA、6%葡萄糖胁迫处理。结果显示:在特定浓度梯度的NaCl处理后,沉默株系c4-2的主根相对伸长量和种子萌发率都被明显抑制,并且被抑制效果远远高于野生型株系。然而,在特定浓度梯度的ABA和葡糖糖处理后,沉默株系c4-2的主根相对伸长量和种子的萌发率虽然也都有一定程度的抑制,但是其被抑制效果远远低于野生型拟南芥。结果显示沉默了VHA-c4基因后,显著降低了拟南芥对NaCl的耐受性,影响了其的生长发育,然而对ABA和葡糖糖的抑制作用却表现为很不敏感,这可能是因为H~+-ATPase在盐胁迫信号通路和ABA信号通路中起着不同的(正负)调控功能。     

利用同源重组提高外源GUS基因在植物组织中表达

将１８Ｓ ｒＲＮＡ基因的部分片段,或烟草的核骨架结合序列（ＳＡＲｓ）作为同源序列与外源ＧＵＳ基因作为报告基因构建成用于基因打靶载体,以枪或农杆菌介导转化到拟南芥的根组织中,检测ＧＵＳ基因瞬间表达的结果显示,两种同源基因序列均可提外源ＧＵＳ基因的表达。     

灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因（CgVP1）过表达提高拟南芥的耐盐性。

克隆获得包含完整开放阅读框（0RF）的灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因（CgVP1）cDNA序列,构建成基因表达载体pCAMBIA1301．1-CgVPl后,利用根癌农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,再以抗性筛选方法获得了T3代纯合的转基因植株,经检测外源目的基因已经整合到拟南芥基因组中并能正常表达。分析结果表明,在拟南芥中过表达劬VP1基因后提高了植株抗盐胁迫的能力。     

高表达miR396小分子导致拟南芥花柱头弯曲

MicroRNAs（miRNAs）是大小约21个碱基、内源、非编码的小分子RNA。以拟南芥（Arabidopsis thaliana）miR396小分子为研究对象,分别克隆到了miR396小分子的两个前体（MIR396a,MIR396b）,得到了转基因植株。通过转基因植株的遗传学研究发现,高表达miR396小分子导致转基因拟南芥的花柱头弯曲。花柱头的弯曲影响了角果的正常发育。另外,Northern杂交结果表明转基因拟南芥花部位的miR396及其前体的表达量与对照相比显著增加。这些结果表明高表达miR396小分子可以导致拟南芥花柱头弯曲。     

转GFP::cDNA基因拟南芥筛选及相关基因的功能分析

本研究以随机GFP::cDNA融合基因转基因拟南芥为材料,筛选到在细胞核或在细胞核和细胞质中均表达GFP信号的转基因株系58个。对这些转基因株系中的cDNA插入片段进行克隆,获得4株插入片段能按原初编码框进行编码的转基因株系。对插入片段为编码富含甘氨酸蛋白AtGRP8 C-末端(富含甘氨酸的结构域)的转基因株系R2的表型分析发现,连续白光、红光或蓝光下其幼苗的下胚轴比野生型的要短,且较低光照强度白光(低于100μmol m-2s-1)、蓝光(低于75μmol m-2s-1)下的差异更加明显,但是黑暗中其幼苗的下胚轴与野生型相比无明显差异,表明AtGRP8蛋白可能通过其C-末端功能域参与调控拟南芥的光形态建成反应。     

利用流式细胞仪分选拟南芥根尖发育早期非根毛细胞

建立了应用流式细胞仪分选植物特定类型细胞的方法。以拟南芥（Arabidopsis thaliana）Wer：：GFP转基因株系为材料,用激光共聚焦显微镜鉴定GFP的表达位置,采用酶解法制备拟南芥根尖原生质体,应用流式细胞仪荧光激活细胞分选技术（FACS）分选收集GFP阳性细胞,并提取细胞的RNA。结果表明,Wer：：GFP转基因株系仅在根表皮发育早期的非根毛细胞中表达GFP;利用酶解法制备的根尖原生质体数目较多;从FACS分选收集的细胞中提取的RNA质量较好,可用于研究特定类型细胞的基因表达谱。应用流式细胞仪分选拟南芥非根毛细胞的方法为研究植物特定类型细胞的基因表达谱及基因功能奠定了技术基础。     

拟南芥VQ基因家族响应抗性相关激素表达谱分析

近年来与WRKY转录因子相互作用的VQ-motif蛋白逐渐引起广泛关注.它是一类植物特异性蛋白,目前在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中已鉴定到34个成员,据其所编码氨基酸的序列相似性构建系统进化树,这34个成员聚集成两大簇.实时定量荧光PCR分析表明在SA(水杨酸),MeJA(茉莉酸甲酯),ACC(乙烯前体),ABA(脱落酸)处理下AtVQ基因家族中有多个成员分别受SA,JA,ET高倍诱导,部分成员受SA,JA,ET中两种激素诱导,其中AtVQ3,AtVQ18,AtVQ23和AtVQ24同时受SA,JA,ET诱导,仅AtVQ27受ABA诱导,推测拟南芥VQ家族成员在抗病方面起作用.     

SRK-SCR转基因拟南芥自交不亲和性的研究进展

十字花科植物自交不亲和性（SI）受墨位点（S-locus）编码的sRK和sCR控制,它们分别是柱头和花粉中的sI特异识别因子。野生型拟南芥不具有sI,而近来通过转基因手段将外源艘K—scR基因转入野生型拟南芥可以使其表现sI,由此建立了一个可用于十字花科sI研究的新型模式植物。本文综述了利用这种转基因拟南芥在SI机制及进化方面取得的进展,包括sI新基因的挖掘、候选基因功能分析和拟南芥生殖模式的转变等。     

水稻OsYDA基因调控气孔发育的功能分析

气孔是植物特化的表皮结构,在植物蒸腾过程和与外界气体交换过程中起到重要作用。拟南芥YDA（AtYDA）是MAPK级联信号途径中的一种激酶（MAPKKK4）,它在叶片气孔的发育过程中起着负调控的作用。AtYDA功能缺失导致叶片气孔显著增加,而表达组成型激活形式的AtYDA（ΔN-YDA）则会导致表皮产生无气孔表型。本研究克隆了水稻中与AtYDA同源的2个基因OsYDA1和OsYDA2。在拟南芥中过量表达这2个基因都导致了叶片气孔密度的减少和叶片失水速率的降低。而表达ΔN-OsYDA1和ΔN-OsYDA2的转基因植株则呈气孔系数下降的表型。这表明OsYDA与AtYDA在调控气孔发育的功能上具有保守性。