影响根癌农杆菌介导的木霉菌遗传转化因素分析

采用根癌农杆菌介导的转化方法,以木霉菌分生孢子为受体材料,对影响转化效率的主要因素进行了分析。结果表明,农杆菌菌株类型、初始菌液量、分生孢子浓度、共培养时间以及乙酰丁香酮的诱导等因素对转化效率都具有重要的影响。通过对这些因素的分析,基本得出了根癌农杆菌转化系统对木霉菌遗传转化的特点和规律,为将该转化系统用于其它丝状真菌的遗传转化提供了重要参考。     

根癌农杆菌介导里氏木霉转化体系的建立和条件优化

目的:采用根癌农杆菌介导的转化方法实现丝状真菌里氏木霉的遗传转化,并优化转化条件.方法:构建含潮霉素抗性基因(hph)的双元载体pCAM-hph后,转化根癌农杆菌LBA4404获得转化菌株.将根癌农杆菌的转化菌株和里氏木霉的分生孢子共培养后在含100μg/mL潮霉素的抗性平板上筛选里氏木霉转化子,并采用PCR扩增和序列测定对转化子中的插入片段进行了分析.结果:使用根癌农杆菌介导的转化方法转化里氏木霉,每106个分生孢子可获得25.8个转化子.最佳的转化条件为:农杆菌初始浓度为OD660约为0.8,孢子数为106个,共培养时间为48h,pH为5.0～5.5,培养温度为28℃.结论:建立了根癌农杆菌介导的里氏木霉转化方法,并获得了最佳的转化条件.     

根癌农杆菌介导的黑曲霉遗传转化体系的建立及优化

基于根癌农杆菌介导的遗传转化方法的独特优点,研究黑曲霉转化过程中各主要影响因素,建立高效的黑曲霉遗传转化方法。构建双元载体pBI-hph,通过电转导入农杆菌LBA4404中,以黑曲霉TCCC41056为受体菌株,利用潮霉素B基因作为筛选标记,对影响转化效率的孢子悬液的新鲜程度及浓度、农杆菌菌液浓度、共培养时间、共培养温度这五个条件进行分析,建立根癌农杆菌介导的黑曲霉遗传转化体系。实验结果表明,上述条件对黑曲霉的转化效率有较大的影响,通过优化,黑曲霉转化效率可达83个转化子/10⁷分生孢子;整合到黑曲霉基因组的外源基因可以稳定遗传,在转接10代后遗传性能仍保持稳定,并在众多转化子中筛选得到了糖化酶活力提高18%的黑曲霉突变株。根癌农杆菌介导的黑曲霉转化体系的建立,为进一步研究黑曲霉的功能基因以及开发黑曲霉表达系统提供了有力的手段。     

根癌农杆菌介导的赭曲霉遗传转化体系的建立

赭曲霉在工业上用于甾体C-11α羟基化。为了对现有赭曲霉生产菌株进行遗传改造,以农杆菌LBA4404作为侵染菌株,以赭曲霉(TCCC41060)作为受体菌株,以潮霉素B基因作为筛选标记,成功建立了根癌农杆菌介导的赭曲霉遗传转化体系并对其转化效率的主要影响因素,如农杆菌浓度、孢子浓度、共培养时间和温度等进行了分析。在最佳条件下,转化效率可以达到57个转化子/108个分生孢子。随机挑选的8个阳性转化子10代连续培养结果表明所获得的转化子能稳定遗传。该遗传转化体系的建立为赭曲霉菌株的定向遗传改造提供了重要的操作平台。     

根癌农杆菌介导的木霉遗传转化及应用进展

木霉作为土传植物病原菌的生防真菌,研究其功能基因具有重要的意义。根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)为木霉功能基因的研究提供了一个强有力的工具。对根癌农杆菌介导木霉遗传转化的机理、特点、方法及其在木霉中的应用进行了综述。     

不同诱导方法对农杆菌介导的木霉菌遗传转化效率的影响

[目的]比较不同诱导方法对根癌农杆菌EHA105介导的哈茨木霉T88遗传转化体系转化效率的影响,以确定最佳的诱导方法.[方法]通过对复铺培养基法、转膜培养法和液体共培养法转化效率的比较来确定3种方法的优劣.[结果]复铺培养基法转化效率约为10个转化子/107个木霉孢子,转膜培养法转化效率约为20个转化子/107个木霉孢子,液体共培养法转化效率达到100个转化子/107个木霉孢子.[结论]在农杆菌介导的木霉菌遗传转化体系中,液体共培养法的转化效率最高,是常用的复铺培养基法及转膜培养法转化效率的5-10倍.     

改良ATMT转化技术在深绿木霉基因敲除中的应用

木霉菌是环境中具有重要经济价值的丝状真菌之一。高效率的基因敲除技术是深入研究木霉菌功能的必要手段。研究改进了传统的农杆菌介导的遗传转化技术(ATMT),成功构建深绿木霉T23中碳代谢抑制因子cre1基因敲除突变株。首先查找深绿木霉全基因组序列,比对并扩增cre1基因侧翼序列,以改造后的p1300qh质粒为骨架构建cre1敲除载体p C1300qh:cre1-up∷hyg∷cre1-down,转化到农杆菌AGL-1。通过优化ATMT转化中木霉菌分生孢子浓度,改良培养方式和延长诱导转化时间等参数,获得最佳转化条件:木霉菌分生孢子浓度为8×10~6,筛选培养基改为IM培养基,诱导转化时间延长,成功筛选到可能的转化子10个。最后,经鉴定有1个转化子为cre1敲除转化子,9个为T-DNA随机插入。因此,为深绿木霉菌基因功能研究提供了可借鉴的高效便捷的遗传转化方法。     

根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化因素的研究进展

根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化体系,是当前研究真菌基因组学的有力工具,广泛运用于真菌随机插入突变体库的构建和基因打靶。概述了根癌农杆菌介导的丝菌转化的大致过程,转化效率的影响因素。     

根癌农杆菌介导的黄瓜转基因研究进展

黄瓜Cucumis sativus是世界性的重要蔬菜作物。农杆菌介导的转基因技术是研究植物基因功能及品种改良的重要手段。为进一步加快黄瓜的转基因研究和育种进程,文中针对农杆菌介导的黄瓜遗传转化方法,从黄瓜再生能力的影响因素、遗传转化条件和过程中各类添加物质等方面,阐述了根癌农杆菌介导的黄瓜转基因研究进展及存在的问题,并对提高黄瓜遗传转化效率和安全筛选标记的应用等前景进行了展望,以期为黄瓜抗逆育种和果实品质改良等研究提供参考。     

根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展

根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化是近年建立起来的一种新方法,该方法和以往的真菌转化体系相比具有转化方法简单、材料易得、效率高以及转化子中T-DNA单拷贝插入比例高等特点。就根癌农杆菌转化的丝状真菌种类、转化的具体过程以及影响转化效率的因素等方面进行了综述,并展望了该方法的应用前景。     

离子注入水稻愈伤组织提高农杆菌转化效率的初步研究

通过ＧＵＳ报告基因表达的组织化学染色分析,我们发现低能氮离子束注入水稻愈伤组织可显著提高根癌农杆菌介转基因效率,这为克服单子叶植物对根癌农杆菌不敏感性、提高遗传转化效率的研究提供了一条新的途径。     

根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究及应用

根癌农杆菌介导转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）具有转化效率高、遗传稳定、适用范围广等诸多优点,已成为真菌遗传转化研究中的强有力手段,在真菌基因资源开发、真菌性疾病研究和外源蛋白表达研究中发挥巨大作用。本文概述了根癌农杆菌转化法在真菌转化中的研究进展、技术优缺点、转化机制、实验方法和应用现状,着重介绍影响其转化效率的因素并对优化方法进行探讨,展望了该技术在真菌基因资源发掘、基因编辑等方面的应用前景,为今后真菌的遗传转化研究提供参考。     

链格孢ATMT转化体系的构建及弱毒突变株验证

本文利用来自质粒pUCATPH的构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子(PtrpC)、终止子(Ttrpc)和潮霉素磷酸转移酶抗性基因(hph)以及植物表达载体pROK Ⅱ成功构建了适用于丝状真菌的根癌农杆菌介导转化的双元载体pROKIIHPH,并转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404,建立了根癌农杆菌LBA4404介导的链格孢Alternaria alternata分生孢子转化体系;再从乙酰丁香酮(AS)浓度、不同的共培养时间、受体菌分生孢子浓度和农杆菌菌液浓度对A.alternata转化效率的影响对体系进行优化.结果确定了根癌农杆菌菌液体积为200 mL(OD_(600)=0.15),A.alternata分生孢子浓度为10~6个/mL,在A.tumefaciens的预培养时期以及与A.alternata共培养时期分别加入200 μmol/LAS,共培养时间48 h,转化率达120～200个/10~5分生孢子.在所筛选的约800个转化子中获得了1株毒性明显低于野生菌sd1的弱毒突变株t108,通过PCR验证推测其毒力降低可能由于T-DNA插入阻断了基因的表达.该实验结果为与突变相关基因的研究以及弱毒株t108的进一步研究和利用提供了实验材料,也为深入研究链格孢sd1菌株的基因功能奠定了基础.     

根癌农杆菌介导的日本曲霉转化体系的建立

【目的】通过根癌农杆菌介导的方法构建日本曲霉转化子库,从而筛选出高产甘没氧化酶的日本曲霉突变菌株。【方法】本文通过三亲杂交的方法将双元载体pBI-hphII转移至根癌农杆菌EHA105中并作为侵染菌株,以日本曲霉As5999为受体菌株,建立了农杆菌介导的日本曲霉转化体系,构建了突变体库,并对影响转化效率的根癌农杆菌浓度,乙酰丁香酮(As)加入与否,共培养时间,共培养温度等因素进行了分析。【结果】对转化子的PCR检测和Southern杂交分析表明,T-DNA已整合进日本曲霉基因组中,随机挑选的9个转化子连续转接10代后均能稳定遗传。【结论】该转化体系的建立为筛选出高产甘油氧化酶的日本曲霉突变菌株奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究

利用根癌农杆菌EHA105进行了哈茨木霉Th-33的转化,在优化的转化条件下,EHA105对木霉菌的转化效率约45-100个转化子/106个孢子。本实验室利用该方法已建立了含4000多个转化子的木霉T-DNA插入突变体库。随机挑选24个转化子进行遗传稳定性分析,结果显示转化子经过5代无选择压力连续转接后都能在选择平板上正常生长;潮霉素抗性基因的PCR扩增和Southern blot杂交分析表明,木霉转化子含有该基因,Southern blot杂交进一步表明转化子多为单拷贝随机插入。该转化体系的改进将有利于木霉菌生防功能基因的克隆和作用机制的研究。     

根癌农杆菌介导转化番茄的影响因素

综述影响根癌农杆菌介导番茄转化效率的因素,包括根癌农杆菌菌株类型、Vir基因的活化、选择标记基因、植物基因型、外植体类型、培养基中是否附加植物激素和抑菌抗生素、菌液浓度、侵染时间长短,是否预培养和共培养天数等;同时不同的培养方式也是影响番茄转化效率的主要因素,包括液体培养法、农杆菌介导的floral-dip转化法、超声波辅助农杆菌介导法、农杆菌介导与基因枪轰击结合法等.     

根癌农杆菌转化禾谷类作物及影响其转化的因素

综述了根癌农杆菌转化禾谷类作物的研究现状,根癌农杆菌与禾谷类作物间的相互作用研究,根癌农杆菌成功转化禾谷类的例子;影响根癌农杆菌转化成功的因素,如菌株类型,感受态细胞的选择,Vir基因的活化,选择合适的转化途径等。这些将为利用根癌农杆菌介导的方法,将外源基因导入禾谷类作物提供有益的帮助。     

根癌农杆菌介导的大豆遗传转化

农杆菌介导法是大豆遗传转化的重要方法之一 ,许多实验室应用该方法得到了转基因大豆 ,但目前使用该方法进行转化的效率还比较低 ,尚需深入研究。农杆菌菌株、大豆基因型、组织培养条件、T-DNA的转移效率和转化后的筛选模式都会影响大豆转化的效率。概述了近年来根癌农杆菌介导的大豆遗传转化的一些重要成果 ,以及转化过程中大豆的易感性与农杆菌的转化能力、乙酰丁香酮促进vir基因活化、转化的受体系统和巯基混合物减轻受体材料的褐化、提高T DNA的转移效率等几个重要因素的研究进展 ,并介绍了转化中常用的几个筛选标记基因 (nptⅡ、hpt、bar基因和突变的ahas基因 )及通过共转化法去除标记基因的方法 ,同时对今后研究的重点进行了讨论.     

农杆菌介导生防棘孢木霉菌转化体系的优化

目的:实现棘孢木霉菌T4的遗传转化并优化其转化体系.方法:以潮霉素抗性为选择标记,利用农杆菌转化法介导转化棘孢木霉菌.结果:潮霉素基因成功整合到受体菌基因组中,转化子抗性基因可稳定遗传.结论:最优的转化体系和条件为:IM和CM培养基中AS浓度为200 μg/mL,棘孢木霉T4孢子浓度为106/mL,农杆菌浓度为200 μL( OD600约0.8),共培养时间为48 h,转化效率约为50个转化子/106个孢子.     

根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展

根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是近年来发展的一种新方法 ,与其它方法相比 ,该方法具有操作简便、转化效率高和易得到稳定转化子等特点。目前 ,在根癌农杆菌介导下已实现了多个属种真菌的遗传转化 ,显示出良好的应用前景。综述了根癌农杆菌介导真菌遗传转化的转化机理和T DNA在真菌细胞中的存在方式等方面的研究结果 ,并展望这一方法的应用前景。