泡桐丛枝病病树中的类菌原体与病毒

在泡桐丛枝病病树中检出类菌原体和病毒质粒(15×250～300 nm)。在病叶叶脉筛管细胞中,观察到有些类菌原体似有穿透细胞壁现象,这种现象是否为通过筛孔或破坏细胞壁还有待阐明。这种病毒可以由病树分离、浓缩和接种到草本寄主(心叶烟、普通烟和洋酸浆),并引起系统花叶症状。可从这些病株分离得病毒质粒和回接到泡桐健苗上引起发病。泡桐丛枝病可能系由类菌原体和病毒一起感染所致,丛枝黄化症状可能由前者引起,而花叶症状可能由病毒引起。茶翅蝽(Halyomorpha halys Stal)与传播泡桐丛枝病有关,可能为媒介昆虫。     

泡桐丛枝病病原及其核酸的分离与性质研究

用0.3M的甘氨酸缓冲液(含0.1M的MgCl_2,pH7.4)对泡桐丛枝病病树的新鲜或冰冻组织进行抽提,用蜗牛酶处理,并差速离心,获得泡桐丛枝病类菌原体;然后用蛋白酶E处理,苯酚和氯仿抽提,酒精沉淀,可有效地制备得泡桐丛枝病类菌原体总核酸。所得总核酸在0.6％的琼脂糖凝胶电泳时呈现出大分子和小分子两种电泳带。DNase I RNase A及专一性降解单链核酸的S.酶等分析结果表明,大分子带为DNA,小分子带为RNA,且DNA具有双链性质,RNA具有单链性质。将上述总核酸用RNase A消化,苯酚和氯仿抽提,乙醇沉淀,可获得单一的泡桐丛枝病类菌原体DNA。电泳测得其DNA分子量约为1.5×10~7道尔顿。目前国内外均未见泡桐丛枝病类菌原体核酸报导。     

花生丛枝病原的电子显微镜研究

花生丛枝病普遍发生于海南岛花生种植区,在崖县、儋县大田中更为常见,俗称“花生公”。这种病害,国内过去认为是一种病毒病,但无正式的研究与报道。在国外,对花生丛枝病也仅推测是由类菌原体(MLO)引起的病     

我国禾谷类病毒病的病原问题——Ⅷ.玉米粗缩病病原的研究

通过灰飞虱接种传毒,证明玉米粗缩病毒在玉米中引起粗缩病症,在小麦中引起“绿矮”病症,在水稻中引起黑条矮缩病症。这一方面揭示了小麦“绿矮”病的病原本质,也说明玉米粗缩病毒和水稻黑条矮缩病毒可能不止相近而是同一病毒。在玉米或小麦病株的粗抽提净化液中,可见到三种完整程度不同的病毒质粒:(1)完整的病毒,直径70～75毫微米,A突起高11毫微米;(2)去除一层蛋白外壳的直径65毫微米的亚病毒质粒,具有B突起;(3)经胃蛋白酶处理,去除两层外壳蛋白的核心,直径约45毫微米。这种质粒与简单球状病毒类似,很可能是有第三层对胃酶稳定的蛋白外壳。在抽提液中,特别是根部的抽提液中还有管状碎片,其中完整的病毒质粒排列成行。在小麦或玉米病株超薄切片中,可见到直径66毫微米的病毒质粒分散于原生质中,或与亚病毒质粒共存于病毒质体中,或藏于管状结构中。在灰飞虱唾液腺的超薄切片中,也可见到成堆的或在管状物中排列成行的完整病毒。     

柑桔黄龙病病原体及其对抗生素反应的研究

1978年3～9月在广东省普宁县和杨村华侨柑桔农场,采典型的黄龙病株的春、夏、秋梢,用电子显微镜检查叶脉韧皮部组织,在筛管细胞内发现多型性的类菌原体(MLO),大小为60～700nm。质粒内含物中有纤维状核酸物质存在。双层膜厚度为20nm 左右。病株除存在类菌原体外,尚有线状病毒质粒。在病株树干注入盐酸四环素,类菌原体出现萎缩、变形,聚集崩坏现象,注药后病情受到明显的抑制。     

我国禾谷类病毒病的病原问题——Ⅷ.玉米粗缩病病原的研究

通过灰飞虱接种传毒,证明玉米粗缩病毒在玉米中引起粗缩病症,在小麦中引起“绿矮”病症,在水稻中引起黑条矮缩病症。这一方面揭示了小麦“绿矮”病的病原本质,也说明玉米粗缩病毒和水稻黑条矮缩病毒可能不止相近而是同一病毒。在玉米或小麦病株的粗抽提净化液中,可见到三种完整程度不同的病毒质粒:(1)完整的病毒,直径70～75毫微米,A 突起高11毫微米;(2)去除一层蛋白外壳的直径65毫微米的亚病毒质粒,具有B 突起;(3)经胃蛋白酶处理,去除两层外壳蛋白的核心,直径约45毫微米。这种质粒与简单球状病毒类似,很可能是有第三层对胃酶稳定的蛋白外壳。在抽提液中,特别是根部的捕捉液中还有管状碎片,其中完整的病毒质粒排列成行.在小麦或玉米病株超薄切片中,可见到直径66毫微米的病毒质粒分散于原生质中,或与亚病毒质粒共存于病毒质体中,或藏于管状结构中。在灰飞虱唾液腺的超薄切片中,也可见到成堆的或在管状物中排列成行的完整病毒。     

枣疯病类菌原体抗血清的制备及其应用的初步研究

以确证枣疯病类菌原体抗原性的有无为目的,采收病树新梢茎皮用差速离心法进行了抽提分离。将此类菌原体抽提物用作抗原,对家兔免疫注射,制备了枣疯病类菌原体抗血清。用血清学方法测定了免疫原的抗原性及抗体效价。结果表明,枣疯病类菌原体具有抗原性。但其特异性抗体效价不高,仅是1/32.实验还证明了ELISA技术可以用予枣疯病类菌原体抗血清的研究。     

柑桔黄龙病病原体及其对抗生素反应的研究

1978年3～9月在广东省普宁县和杨村华侨柑桔农场,采典型的黄龙病株的春、夏、秋梢,用电子显微镜检查叶脉韧皮部组织,在筛管细胞内发现多型性的类菌原体~*(MLO),大小为60～700nm。质粒内含物中有纤维状核酸物质存在。双层膜厚度为20nm左右。病株除存在类菌原体外,尚有线状病毒质粒。在病株树干注入盐酸四环素,类菌原体出现萎缩、变形,聚集崩坏现象,注药后病情受到明显的抑制。     

矮化枣树叶中小分子环状RNA的初步研究

枣树矮化病是我国枣树苗繁育中新发现的重要病害,其症状表现为节间短缩,枝叶密挤,呈丛状。病树比相同条件下的正常树约矮二分之一。其病因未见有研究报道。我们对病株叶组织抽提液,用电子显微镜没有观察到病毒颗粒和类菌原体。从病树和正常枣树叶的细胞核抽提液中,用正反和垂直双向凝胶电泳方法分析细胞核RNA,结果发现,病株叶细胞核RNA中含有环状低分子量的RNA。这是我国首次在矮化枣树叶细胞核中分离到的环状小分子RNA。这一发现将对枣树矮化病的病因研究提供一个有用的线索。     

泡桐丛枝病类菌原体DNA的分子克隆与序列分析

以部分纯化的泡桐丛枝病类菌原体为材料,抽提ＤＮＡ,进行ＥｃｏＲ Ⅰ－Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切,回收的ＤＮＡ 片段插入到载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋ ）中,转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ ５α。经双重杂交初筛以及Ｄｏｔｂｌｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交的回交确证,获得两个仅与患丛枝病泡桐总核酸有杂交而与健康对照无杂交的克隆（Ａ４,１．６９ ｋｂ;Ｃ４２,２．０８ ｋｂ）。部分测序的结果表明：Ａ４ 和Ｃ４２插入片段中Ａ＋Ｔ含量分别为７２．５％ 和６７．９％ ,具有典型支原体属微生物的碱基组成特征     

泡桐丛枝植原体16S rDNA和延伸因子基因序列分析

对采自陕西、山西、甘肃、河南、河北、山东各省的泡桐丛枝病材料,利用巢式扩增,均得到16S rDNA基因片段约1.2kb;扩增得到植原体延伸因子(EF-Tu)tuf基因,长度约为850bp.。通过将16S rDNA基因片段和延伸因子(EF-Tu)tuf基因序列与已知植原体16Sr各组成员进行同源性比较,确定我国大陆泡桐主栽区陕西、山西、甘肃、河南、河北、山东各省与已经报道的台湾省泡桐丛枝植原体基本一致,均为同一个种,没有株系的分化,全部归属于植原体16SrI-D组,从而确定了其分类地位。     

用PCR及RFLP方法分析支原体与植原体的同源性

将猪鼻支原体和泡桐丛枝病植原体的16S rDNA进行PCR扩增,分别得到一条1 kb左右的扩增片段。PCR扩增产物用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ和SmaⅠ进行RFLP(限制性片段长度多态性)分析,发现用RFLP分析猪鼻支原体和泡桐丛枝病植原体16S rDNA序列同源性的相关系数为0.72。     

人参坏死病的研究

本文首次报告人参坏死病及其病原体。通过罹病人参各部位的超薄切片,在筛管细胞中,观察到大量具单位膜而无细胞壁、多形态的类菌原体(MLO)。这种类菌原体大小为80—1400nm,外膜厚度8—12nm。以四环素喷叶试验证明,四环素对病状有抑制作用。初步认为人参坏死病是由类菌原体引起的。     

侵染番茄的黄瓜花叶病毒（CMV）株系特性的比较研究

从山东省主要番茄种植区病毒样本中分离到111个黄瓜花叶病毒(CMV)分离物,根据病毒的寄主范围和症状,初步鉴定为三个株系:番茄蕨叶株系(CMV-ToF)、番茄花叶株系(CMV-ToM)和番茄轻花叶株系(CMV-ToL)。三株系除在生物学特性存在明显差异外,其病毒粒体形态大小,电泳迁移率,病毒外壳蛋白亚基分子量、核酸组分以及病毒粒体血清学特性亦存在差别。     

用ELISA和Dot-ELISA方法检测植物病原的比较研究

比较了ELISA和Dot-ELISA方法检测番茄巨芽类菌原体(Tomato Big Bud Mycoplatma-Like Organism,TBB-MLO)、番茄斑萎病毒(Tomato Spotted Wilt Virus,TSWV)和青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)的差异,结果表明,两种方法对番茄斑萎病毒无明显差异,对番茄巨芽类菌原体,用Dot-ELISA比用ELISA的检测灵敏度高50—100倍,对青桔假单胞菌,用Dot-ELISA比用ELISA检泓抗原     

泡桐丛枝植原体tRNA异戊烯基焦磷酸转移酶基因克隆、原核表达及功能分析

【目的】为了鉴定植原体tRNA异戊烯基焦磷酸转移酶基因(tRNA-ipt)的表达及蛋白功能,探索植原体致病机理。【方法】对泡桐丛枝、桑萎缩、长春花绿变及苦楝丛枝植原体tRNA-ipt基因完整序列进行PCR扩增和生物信息学分析。对泡桐丛枝植原体tRNA-ipt基因进行原核表达并制备抗体。利用Western blot和FITC间接免疫荧光显微镜检测其在植原体中的表达。使用分光光度计分析该基因对大肠杆菌生长的影响,用ELISA测定转化菌株细胞分裂素含量。【结果】首次发现泡桐丛枝、桑萎缩、长春花绿变及苦楝丛枝植原体中完整tRNA-ipt基因,大小为876 bp,编码291个氨基酸,且N端均含有ATP/GTP结合位点保守序列(GPTASGKT)。4种植原体tRNA-IPT之间的氨基酸序列相似率为99.1%-99.5%,与同组植原体同源性在95.4%-99.3%,与其他组植原体同源性低于70%。SDS-PAGE结果显示tRNA-IPT蛋白在大肠杆菌中得到表达。首次获得泡桐丛枝植原体tRNA-IPT抗体并检测到该蛋白在泡桐发病组织中的特异表达。经过对转化菌株生长曲线及玉米素含量的测定,发现该基因能促进大肠杆菌后期生长和玉米素核苷的积累。【结论】4种植原体tRNA-ipt基因编码相同特性的功能蛋白,泡桐丛枝植原体tRNA-IPT蛋白能够在植原体中表达,根据该基因对异源菌株生长速率和激素合成的影响推断该蛋白可能参与植原体的细胞分裂素合成,在致病过程中起到重要作用。     

芝麻病毒病害研究：Ⅱ.芝麻黄花叶病病原鉴定

继对芝麻矮化坏死病源研究之后,又对普遍发生的芝麻黄花叶病害分离物(YMo—I)进行了系统鉴定。该分离物普遍存在于各芝麻主产区,普通年份发病率为1～5％。YMo—I侵染芝麻引起叶片褪绿及黄绿相间花叶。摩擦接种能够侵染4科12种(品种)植物。局部侵染苋色藜、昆诺藜;系统侵染大豆、花生、望江南、克氏烟等。该病毒能够由桃蚜、花生蚜、大豆蚜以非持久性方式进行传播。ELISA检测其病株种子带毒率为0.5％,但尚未发现种生病苗。病毒在组织汁液中存活期3天;钝化温度55～60℃,稀释限点4×10~(-3)。提纯病毒为弯曲线状粒体,大小约为13×730nm。并有极易凝聚的趋势。病组织中诱导大量典型PVY第一亚组的风轮形和卷筒状细胞质内含体和少数多边形结晶核内含体。血清学上该病毒与花生条纹病毒(PStV)、西瓜花叶病毒—2(MMV—2)密切相关,与花生斑驳病毒、大豆花叶病毒弱相关;与芜菁花叶病毒不相关。但它不侵染WMV—2的寄主—黄瓜,并且该病害田间的发生流行与芝麻、花生的间作方式以及PStV在花生田间的流行密切相关。根据上述结果,YMo—I分离株被鉴定为花生条纹病毒的一芝麻分离株。     

苜蓿花叶病毒马铃薯杂斑株系的分离和鉴定

在前茬为苜蓿的马铃薯田里,有一种叶上出现鲜黄病斑的马铃薯黄斑花叶病。病叶汁液在普通烟和心叶烟上产生黄斑花叶和斑驳。在菜豆和豇豆上产生红褐色和紫红色局部斑。部分提纯的病毒是平均直径20．6nm、长17．5—74nm的多组分短杆状粒体。致死温度55—60℃,稀释限点10-3,体外存活期3—4天。将分离物回接马铃薯,3--6周后,表现类似田间病株症状。接种紫花苜蓿呈现黄斑花叶。试验证明,引起上述病害的病原为苜蓿花叶病毒马铃薯杂斑株系,此种病害与国外报道的马铃薯杂斑病(Porto-calico disease)为同一种病害。此病可通过块茎传播。     

侵染扁豆的三叶草黄脉病毒的鉴定

1987年从泰安表现系统花叶的扁豆上分离到一个分离物B_2,汁液摩擦接种9科38种植物,它可侵染5科10种植物,在扁豆和昆诺藜上引起系统花叶,在苋色藜上引起局部枯斑。该分离物钝化温度为60—65℃,稀释限点为10~(-3)—10~(-4),体外存活期为3—5天。可由桃蚜传播;病毒粒体线条状,大小为700—760×12nm病叶细胞内有风轮状内含体,该分离物与三叶草黄脉病毒的抗血清有明显的-阳性反应。根据这些特性,该病毒属于马铃薯丫病毒组的三叶草黄脉病毒。     

柑桔碎叶病毒研究

用汁液摩擦接种方法对柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)进行了进一步的生物学鉴定.结果表明,该病毒除在豇豆上引起枯斑外,还侵染克里芙兰烟(Nicotianaclevilandii)产生系统斑驳和轻花叶,侵染昆诺藜(Chenopodium quinoa)和苋色藜(C.amaranticolor)引起系统坏死和花叶,侵染鸡冠花(Celosia cristata)引起局部环斑.这些草本寄主均可作为CTLV的指示植物.在发病的柑桔叶汁液中,测得CTLV的稀释限点为10~(-5).经汁液摩擦接种,可以将CTLV从克里芙兰烟传播到木本指示植物柑桔和枳橙上.感病植物材料的组织超微结构观察结果表明:CTLV感染柑桔、枳橙、克里芙兰烟和昆诺藜均使其叶肉薄壁细胞的叶绿体出现淀粉沉积、叶绿体片层结构解体和消失;病毒在受感染的植株叶脉韧皮部细胞中紧密聚集,形成病毒结晶体;这种结构也出现在叶肉薄壁细胞中.这是关于该病毒组织病变的首次报道.用直接负染方法从感染CTLV的柑桔(枳橙)、克里芙兰烟和昆诺藜病叶中均能检查到线状病毒粒子,用改良的Deriick’s免疫电镜方法和琼脂双扩散方法测定均显示该病毒…