丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性,以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制,打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化,对治疗的评价,以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。     

HCV5＇端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇端非编码区（５＇ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒,获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定。将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｏｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点之间,所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ＿７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应,产物经凝胶电泳及特异引物ＲＴ－ＰＣＲ,证实ＳＰ６引导的是正义ＲＮＡ,Ｔ７合成的是反义ＲＮＡ,其大小分别力４２９ｂｐ和３６２ｂｐ。并证实所得ＲＮＡ力ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ转录而来。获得的ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ和ＲＮＡ在常规逆转录和ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照,对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时,ＨＣＶ５＇ＮＣＲ体外转录载体的构建可用于制各ＲＮＡ探针和反义ＲＮＡ,改进后还可作为定量ＰＣＲ的竞争性模板。     

利用脊髓灰质炎病毒5‘NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒（ＰＶ）ＲＮＡ聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体ｐＳＧ５质粒上,分别构建了４个表达ＲＮＡ聚合酶的质粒。体外转录实验证明,ｐＳＧ５－ＰＯＬ１．９９和ｐＳＧ５－ＰＯＬ２．０３质粒转染细胞的提取物促进了特异的ＲＮＡ转录,表明两质闰可表达ＲＮＡ聚合酶。将ＰＶ的５’ＮＣＲ序列插在载体ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１的ＣＭＶ启动子下游,构建了ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１－５’ＮＣＲ质粒;     

用DNA重组法表达丙肝病毒部分NS_4-NS_5基因

用ＤＮＡ重组法表达丙肝病毒部分ＮＳ_４－ＮＳ_５基因祁自柏,谷金莲,李河民（中国药品生物制品检定所,北京１０００５０）丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）是一种ＲＮＡ病毒,为研究其复制机理,制备检测丙肝抗体的诊断试剂,需大量纯化的各种丙肝病毒蛋白,我们在国内首次用Ｄ...     

丙型肝炎病毒PNA打点杂交检测方法同RT—PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交检测血清中ＨＣＶ ＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５＇端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应检测血清中ＨＣＶ ＲＮＡ折方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异的检出血清中ＨＣＶ ＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法     

丙型肝炎病毒与宿主细胞蛋白的相互作用及其意义

蛋白－蛋白的结合是病毒与宿主细胞相互作用的分析基础。随着酵母双杂交系统等研究蛋白－蛋白结合新技术的广泛应用,人们对病毒复制的本质及致病机制有了更新的认识,本文综述了丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白Ｃ及非结构蛋白５Ａ（ＮＳ５Ａ）与宿主蛋白相互作用的进展,并讨论了它们在ＨＣＶ致病中的作用。     

丙型肝炎病毒中国株非结构蛋白2~3部分基因cDNA克隆序列分析及表达

丙型肝炎病毒 (ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ)是输血后和许多社区获得性非甲非乙肝炎的主要致病因子。ＨＣＶ为单股正链ＲＮＡ病毒 ,其基因组长约 9.5Ｋｂ ,编码区含一个大开放读码框架 ,编码 30 1 0 30 33氨基酸残基的多蛋白前体 ,经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶加工成具有生物学功能的成熟蛋白。ＨＣＶ各区域的分布顺序是 :Ｃ Ｅ1 Ｅ2 ｐ7 ＮＳ2 ＮＳ3 ＮＳ4Ａ ＮＳ4Ｂ ＮＳ5Ａ ＮＳ5Ｂ[1] 。本文我们应用ＲＴ ＰＣＲ方法从ＨＣＶ患者血清中扩增编码病毒蛋白酶的非结构蛋白 (ＮＳ2 ＮＳ3)部分基因 ,对其核苷酸序列进行了分析 ,…     

HCV NS5A基因表达及其在血清学检测中的应用评估

人丙型肝炎病毒 (ＨＣＶ)感染可引起丙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌[1] 。丙型肝炎病毒是单股正链ＲＮＡ病毒 ,基因组约长 9.5ｋｂ ,仅有一个开放阅读框 ,编码一个大的聚蛋白前体 ,由宿主蛋白酶和病毒编码的蛋白酶加工成多个成熟蛋白。非结构蛋白ＮＳ5Ａ分子量为 56ｋＤ/ 58ｋＤ。目前对ＮＳ5Ａ蛋白的功能尚不清楚 ,ＮＳ5Ａ蛋白可降低干扰素治疗效果[2 ] ;ＮＳ5Ａ蛋白含核定位序列 ,因此人们推测它在ＨＣＶＲＮＡ复制过程中可能起一定的作用[3～ 4 ] 。本研究在大肠杆菌中表达全长ＮＳ5Ａ蛋白 ,提纯后ＮＳ5Ａ蛋白能与大多数丙肝阳性血清起强烈…     

HCV RNA的检测方法简介

本文讨论了检测丙型肝炎病毒核糖核酸（ＨＣＶＲＮＡ）的样本来源和处理,引物的设计,合成和选择等问题;重点介绍了蛋白酶Ｋ消化法,聚乙二醇沉淀法,异硫氰酸胍一步法,硅凝胶提取法和直接捕获法提取ＨＣＶ　ＲＮＡ的５种方法,以及一步ＰＣＲ法,常规ＲＴ－巢式ＰＣＲ,直接ＲＴ－巢式ＰＣＲ,化学修饰的ＲＴ－巢式ＰＣＲ,联合ＰＣＲ,双温ＰＣＲ和定量竞争性ＰＣＲ等７种ＰＣＲ方法检测ＨＣＶ　ＲＮＡ,用ＰＣＲ检测ＨＣＶ　ＲＮＡ方法的标准化以及检测ＨＣＶＲＮＡ具有非常重要的意义。本文还介绍了一种新型的定量方法－ｂＤＮＡ信号放大技术检测ＨｃＶＲＮＡ。     

人原发性肝内胆管细胞癌中HCV RNA及其NS3区抗原的分布及意义

应用原位分子杂交及免疫组分方法,使用地高辛标记ＨＣＶ５’非编码区探针及抗ＨＣＶ ＮＳ３区Ｃ３３ｃ单克隆抗体,对３５例人原发性肝内胆管细胞癌（ＰＩＣ）和癌旁肝组织的ＨＣＶ ＲＮＡ及其ＮＳ３抗原进行检测结果发现ＨＣＶ ＲＮＡ在ＰＩＣ中的阳性率为８３％,ＨＣＶ ＲＮＡ定位于癌细胞浆中,个别病例并在淋巴细胞、肝窦内皮细胞和枯否氏细胞中发现阳性信号。ＨＣＶ ＮＳ３区Ｃ３３ｃ抗原在ＰＩＣ的阳性率为８９％,阳性     

猪瘟病毒兔化弱毒株cDNA片段的克隆及序列分析

猪瘟是猪最重要的传染病之一,往往给养猪业造成重大经济损失,猪瘟的病原为猪瘟病毒（ＨＣＶ）,属黄病毒科,瘟病毒属成员,其基因组为单股正链ＲＮＡ,长度为１２３ｋｂ,仅含有一个大的开放阅读框架,编码一个含３８９８个氨基酸残基（ＡＡ）的多聚前体蛋白［１,２］。目前已经定位的蛋白有５种,即Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅ０、Ｅ１和Ｅ２,它们均由ＨＣＶＲＮＡ５′端所编码,除Ｎｐｒｏ外,其它４种均为ＨＣＶ的结构蛋白［３］。Ｎｐｒｏ为具有自我催化功能的蛋白水解酶,也是多聚蛋白Ｎ端的第一个蛋白水解酶,分子量为２３ｋＤ,Ｃ为构成…     

逆转录-聚合酶链反应技术诊断丙型肝炎病毒感染

本文采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ-ＰＣＲ）技术对２１２例住院及门诊病人其中肝病患者９８例（慢性肝炎４３例、肝炎后肝硬化４７例、原发性肝细胞癌８例）进行ＨＣＶ－ＲＮＡ检测。结果９８例慢性肝病患者血清中ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ阳性２７例（２７．６％）,１１４例非肝病患者血清中ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ阳性９例（７．９％）,两组间差异非常显著（Ｐ（０．０１）,各种肝病患者的ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ阳性率均高于非肝病组。６８例患者同时进行了ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ检测和抗－ＨＣＶ检测,２５例抗－ＨＣＶ阳性的患者中ＨＣＶ－ＲＮＡ-ＰＣＲ,２１例阳性（８４％）,４３例抗－ＨＣＶ阴性的患者中ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ,９例阳性（２０．１％）、有输血及血制品史者４８例,其中ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ阳性１６例（３３．３％）,１６４倒无输血史者中ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ阳性２０例（１２．２％）,两组间差异非常显著（Ｐ（０．０１）。结果表明：１．ＨＣＶ感染与慢性肝病有密切联系,说明ＨＣＶ感染是慢性肝炎、肝硬化、肝癌的致病因素;２．ＨＣＶ-ＰＣＲ法具有特异性好、灵敏度高、简便快速等特点,弥补了抗－ＨＣＶ检测的不足之处,是目前确定ＨＣＶ感染的主要手段;３．ＨＣＶ感染与输血关系密切,因此对献血员进行常规ＨＣＶ检测对预防由输血所致ＨＣＶ感染有着极其重要的临床意义。     

丙型肝炎病毒翻译及调控机制

丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）是单股正链ＲＮＡ病毒,有单一阅读框架,编码约３０１０个氨基酸的病毒前体蛋白。ＨＣＶ基因组结构和病毒蛋白的亲疏水性与黄病毒相似,因此将其归于黄病毒科丙型肝炎病毒群［１］。与黄病毒不同的是,ＨＣＶ５′...     

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶的研究进展

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）非结构３区（ＮＳ３）编码的丝氨酸蛋白酶是ＨＣＶ复制过程中的重要蛋白酶,负责对ＮＳ３、ＮＳ４及ＮＳ５进行加工。ＮＳ４ａ是ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶作用的辅因子,并具有多种活性。ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶有相对特异的底物,其活性不能被一般的丝氨酸蛋白抑制剂所抑制。丝氨酸蛋白酶是ＨＣＶ药物设计的靶目标之一。对其结构与功能的研究有着重要意义。     

肝炎病毒蛋白对双链RNA依赖性蛋白激酶的调节作用

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）和丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）蛋白以及丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）基因组ＲＮＡ与双链ＲＮＡ依赖性蛋白激酶（ＰＫＲ）之间可以进行特异性结合,使病毒感染的靶细胞对干扰素（ＩＦＮ）的敏感性发生了改变。同时,肝炎病毒基因组及其编码产物与感染靶细胞中ＰＫＲ分子之间的结合,将产生广泛的生物学效应。     

乙型肝炎病人重叠感染丙型肝炎的评价

应用ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ法检测５０２例乙肝病人血清,４０１例ＨＢｓＡｇ阳性血清中,有１１４例（２８．４％）抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ双项阳性,２５例（６．２％）ＨＣＶＲＮＡ单项阳性;２１例（５．２％）抗－ＨＣＶ单项阳性。将ＨＢｓＡｇ乙肝病人分成ＨＢＶＤＮＡ,ＨＢｅＡｇ阳性组和ＨＢＶＤＮＡ,ＨＢｅＡｇ阴性组。前者抗－ＨＣＶ阳性率为１１．６％～２０．５％,ＨＣＶＲＮＡ阳性率为１６．２％～２０．５％。后者抗－ＨＣＶ阳性率为２０．２％～５５．６％,ＨＣＶＲＮＡ阳性率为２３％～６０．３％。结果说明长期携带ＨＢＶ者和慢性乙肝病人均可重叠ＨＣＶ感染。ＨＢＶＤＮＡ阳性组抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ阳性率明显高于ＨＢＶＤＮＡ阳性组     

丙肝病毒非结构基因NS_4的基因工程表达

丙肝病毒非结构基因ＮＳ_４的基因工程表达祁自柏,谷金莲,李河民（中国药品生物制品检定所,北京１０００５０）丙肝病毒（ＨＣＶ）基因由结构区和非结构区（ＮＳ１－５）所组成。抗不同病毒蛋白抗体的出现与丙肝发病的关系尚在研究之中。目前,国内丙肝诊断试剂力求包...     

黄瓜花叶病毒山东株(CMV-SD)RNA2全长cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶＳＤＲＮＡ２的５’和３’末端序列,在此基础上,利用ＲＴＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２Ｆ。通过对ｐＣ２５和ｐＣ２３进行序列测定,得到了ＲＮＡ２的全序列。序列分析结果表明ＣＭＶＳＤＲＮＡ２由３０４８ｎｔ组成,其中存在２个部分重叠的阅读框ＯＲＦ１（７９～２６５２ｎｔ）和ＯＲＦ２（２４１４～２７４６ｎｔ）,分别编码８５８ａａ的２ａ蛋白和１１１ａａ的２ｂ蛋白,并在２ａ蛋白的序列中发现了动植物病毒复制酶所特有的两个保守序列。该株系ＲＮＡ２核苷酸序列与分属ＣＭＶＩ亚组的Ｆｎｙ株系和ＩＩ亚组的Ｑ株系ＲＮＡ２的核苷酸序列同源性分别为９１７％和７５６％;２ａ蛋白的氨基酸序列同源性分别为９３８％和６７７％,２ｂ蛋白的氨基酸序列同源性分别为８３０％和５１３％。同源性比较的结果表明ＳＤ株系属于ＣＭＶＩ亚组。     

丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶基因克隆与原核表达

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶（ＲｄＲｐ）是参与病毒基因组ＲＮＡ复制的一个关键蛋白因子,是研究抗ＨＣＶ新型药物的重要靶标,获得纯化的ＲｄＲｐ产物是建立靶向ＲｄＲｐ药物高通量筛选体系和抗病毒药物研究的关键步骤。以ＨＣＶ病毒基因组全长ｃＤＮＡ质粒（ｐ９０／ＨＣＶ ＦＬ－ｌｏｎｇ ｐＵ）为模板,设计了特异性扩增ＲｄＲｐ的引物,通过ＣＰＲ扩增获得编码ＲｄＲｐ的基因。将该基因克隆到Ｔ载体中     

中国丙型肝炎患者中发现新的丙型肝炎病毒核苷酸序列

应用ＲＴ－ＰＣＲ和ＤＮＡ克隆重且技术从中国云南地区丙型肝炎患者血清中克隆到３个丙型肝炎病毒（ＨＶＣ）５?端非编码区（５’ＮＣＲ）核苷酸序列。这３个序列分别来自３个不同的再型肝炎患者。与国内外已发表的ＨＣＶ原型株同源序列比较研究发现,这３个ＨＣＶ５’ＮＣＲ序列中分别存在部分核苷酸序列的缺失或出现插入重复。在ＹＳ２２５－１ ５’ＮＣＲ序列－１５５￣－１７４位之间,有１８个核苷酸序列缺失;在ＹＳ２０３－