透明颤菌vgb基因在产核黄素B.subtilis中的整合表达研究

目的:将透明颤菌血红蛋白vgb基因应用于核黄素的工业化生产。方法:以枯草芽孢杆菌整合载体pAmyE构建了vgb基因的整合表达载体pAudV,采用化学转化法将vgb基因整合到枯草芽孢杆菌GJ08的染色体上,并通过发酵摇瓶实验检测核黄素的产量。结果:得到产核黄素枯草芽孢杆菌GJ09,摇瓶试验结果表明,在限氧条件下核黄素的产量分别提高了5.23%和3.42%。结论:透明颤菌血红蛋白vgb基因能够促进核黄素产量的提高,可以应用于核黄素的工业化生产中。     

产木聚糖酶枯草芽孢杆菌构建及表达条件优化

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有很强的分泌能力,产酶能力强,属于食品级安全微生物.以枯草芽孢杆菌为宿主菌异源表达木聚糖酶,采用同源重组的方法将木聚糖酶基因连接到载体pWB980上,构建表达载体pWB980-xynZF-2,电击转化枯草芽孢杆菌WB600,获得重组工程菌WB600-pWB980-xynZF-2.对重组工程菌进行单因素发酵条件优化和正交试验.结果表明:重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵的最适接种量1％、种龄14 h、装液量50 mL、温度34℃,转速160 r/min、发酵时间192 h.在摇瓶发酵条件下,木聚糖酶产量可达到0.168 U/mL.     

葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵条件优化

为了研究葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中异源表达,笔者从枯草芽孢杆菌中克隆得到带有自身信号肽的葡萄糖醛酸木聚糖酶基因,将其构建到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒中,转化入枯草芽孢杆菌WB800,得到重组菌。通过发酵条件以及培养基成分优化,重组菌中葡萄糖醛酸木聚糖酶酶活达到76.0 U/mL,约为优化前产酶量的5.4倍。葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中实现高效异源表达,为其进一步的实际应用奠定了基础。     

大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的构建及碱性蛋白酶的表达

构建了一个可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中复制,并可以在枯草芽孢杆菌中表达外源蛋白的穿梭表达载体pBE2R.该穿梭表达载体是以pBE2为基本骨架,引入来自pWB980质粒的P43强启动子,并在其下游引入嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽构建而成.试验结果表明,该穿梭表达载体pBE2R可以在大肠杆DH5α和枯草芽孢杆菌WB600中稳定存在,并可以使外源蛋白在枯草芽孢杆菌进行分泌表达,同时也为碱性蛋白酶定向改造提供了高通量筛选平台.     

以绿色荧光蛋白为报告基因的原核启动子检测体系构建

以质粒pMUTIN-GFP 扩增获得的目的gfp 基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBE2-GFP .将组成型启动子P43和诱导型启动子Pspac克隆入pBE2-GFP ,得到重组表达载体pBE-GFP-P43和pBE-GFP-Pspac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌.荧光显微镜检测GFP 蛋白的表达情况.结果 表明,2种不同类型的启动子均能在大肠杆菌BL21和枯草芽孢杆菌1A751中启动gfp 基因的表达.     

蜡样芽孢杆菌ATCC14579核黄素操纵子的克隆及在枯草芽孢杆菌中的表达

利用BLAST从B．cereus ATCC14579的基因组中找到一段与枯草芽孢杆茵核黄素操纵子具有较高相似性的4．6kb大小的基因组DNA片段,该片段中含有完整的核黄素操纵子。该操纵子结构基因的编码产物的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌核黄素操纵子相应结构基因的编码产物的氨基酸序列具有99％的同源性。该片段被克隆到大肠杆茵一枯草芽孢杆茵穿梭载体pHP13M中。表达分析的结果表明B．cereus ATCC14579核黄素操纵子可在大肠杆茵和枯草芽孢杆菌中表达。利用PCR方法用来自枯草杆菌的sac B基因的启动子替换B．cereus ATCC14579核黄素操纵子原有的启动子使其更好表达。替换启动子后的核黄素操纵子在本文使用的发酵条件下有较好的表达,核黄素产量从39．5mg／L增加到61．7mg/L.     

以β-半乳糖苷酶为报告基因的原核启动子检测体系构建

目的:以β-半乳糖苷酶为报告基因构建原核启动子检测体系.方法:以由质粒 pDL 扩增获得的 bgaB 基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体 pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBEB.将组成型启动子P43和诱导型启动子Pcpac克隆入 pBEB,得到重组表达载体 pBEBP43 和 pBEBPapac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌.结果:两种不同类型的启动子均能在大肠杆菌 BL21 和枯草芽孢杆菌 1A751 中启动 bgaB 基因的表达.结论:成功构建具有较为广泛适用性的原核启动子检测体系.     

金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B的表达及活性鉴定

目的:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为基础,在枯草芽孢杆菌中得到具有剪切功能的金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B。方法:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到SplB基因,同源重组到表达载体pHTSHIS上,再转化枯草芽孢杆菌;优化诱导条件发酵枯草芽孢杆菌,离心后超滤浓缩上清液,再经镍柱分离纯化;利用SDS-PAGE、Lowry法对蛋白的相对分子质量、浓度等进行分析,对蛋白的酶切活性进行鉴定。结果:金黄色葡萄球菌基因组DNA经PCR扩增得到与预计大小相符的DNA片段,通过同源重组构建了表达载体pHTS-SplB-His;选取诱导前菌液D_(600nm)为2.0、IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导4 h的最优条件发酵枯草芽孢杆菌,表达大量金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B;蛋白浓缩后,经镍柱分离纯化得到纯度较高且具有剪切功能的金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B。结论:采用枯草芽孢杆菌进行发酵表达,可提高金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B的表达量,并且能够得到具有剪切功能的蛋白。本研究可为外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的发酵技术提供重要参考。     

麦芽糖诱导海藻糖合成酶基因在B.subtilis WB800n中的表达

运用枯草芽孢杆菌中的麦芽糖诱导型启动子调控元件,构建得到麦芽糖诱导海藻糖合成酶的安全表达系统,使其制备的海藻糖能够广泛应用于食品医疗行业。以来源于恶臭假单胞杆菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)的海藻糖合成酶基因Tre S为报告基因,以cre序列定点突变(CG碱基突变为AT碱基)优化后的麦芽糖诱导型的枯草芽孢杆菌操纵元启动子Pglv为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒PHT01为载体骨架,通过Bam H I和Aat II限制酶酶切替换,构建得到高效表达载体Pglv-PHT01-Tre S,将质粒电转化到B.subtilis WB800n并验证其表达效果。成功构建了海藻糖合成酶高效表达质粒Pglv-PHT01-Tre S,并实现了该重组质粒在B.subtilis WB800n中的表达。利用基础发酵培养基优化发酵条件验证结果表明,菌体生长到发酵液吸光值OD600达到1.2时加入终质量分数4.5%的麦芽糖,37℃诱导18 h后胞内的海藻糖合成酶的粗酶活力达到18.9 U/m L。为了提高海藻糖合成酶的表达量,还构建了通过单交叉互换方法敲除了α-淀粉酶基因amy E的重组菌株B.subtilis WB800n(Δamy E),减少了胞外α-淀粉酶对麦芽糖的降解成葡萄糖,提高了麦芽糖的诱导表达效果以及减少葡萄糖的反馈抑制,表达质粒在麦芽糖诱导条件下在该重组菌中海藻糖合成酶酶活提高到了29.2 U/m L。首次成功实现了麦芽糖诱导海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达,为获得制备安全高效的海藻糖合成酶表达系统奠定了基础。     

通过信号肽筛选优化耐高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌

以大肠-枯草穿梭载体p MA5质粒为基本骨架,以来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus NUB3621的耐高温α-淀粉酶基因为目标基因,利用POE-PCR法,成功构建针对淀粉酶的信号肽筛选载体。从枯草芽孢杆菌168基因组中扩增得到46个信号肽,利用POE-PCR法,使46个信号肽分别与线性化的筛选载体形成对应的multimer产物,直接转化枯草芽孢杆菌1A751,得到含不同信号肽的重组菌株。发酵结果显示,除了5个与淀粉酶适配性很低的信号肽,其它信号肽均有不同的引导淀粉酶细胞外分泌的能力,其中bgls引导淀粉酶细胞外分泌的能力最强,上清酶活的峰值达1 393.3 U/m L。     

大肠杆菌、枯草杆菌穿梭表达载体的构建及改造

将大肠杆菌的复制子rep和多克隆位点克隆到枯草杆菌质粒pGDV1的骨架上,即得到大肠杆菌枯草杆菌牙梭庾粒载俸pGDVM。在pGDVM上进行载体表达元件的构建,先后将P59启动子、核糖体结合位点SD和终止子克隆到pGDVM上得到穿梭表达载体GJ01。以β-半乳糖苷酶基因（bga）作为报告基因检测载体的表达活性,在大肠杆菌和枯草杆菌中β-半乳糖苷酶（Bga）酶活性最高达到75.3和83．2个密勒单位,表明所构建的表达载体具有较强的表达能力。以核糖体结合位点（SD、SD3、SD4和SD5）代替表达载体GJ01-bga中的SD,对载体进行改造。所构建的GJD2-bga在大肠杆菌中的最大酶活性为253．8个密勒单位,G]D5-bga在枯草杆菌中的最大酶活性为135．4个密勒单位,表明所构建的载体具有较强的表达活性。由此可以得出不同的SD序列及其与起始密码子的距离不同程度地影响mRNA的翻译效率。     

Estimation of P-to-O ratio in Bacillus subtilis and its influence on maximum riboflavin yield.

Simultaneous growth and riboflavin overproduction were investigated using a previously developed stoichiometric model of Bacillus subtilis metabolism. A fit of model predictions to experimental data was used to obtain estimates of fundamental energetic parameters of B. subtilis. Although multiple solutions describe the experimental data, evidence for a P-to-O ratio of about 1(1/3) mole of ATP produced per atom of oxygen consumed in oxidative phosphorylation was provided by genomic analysis of electron transport components, because no homologue of the proton-translocating NADH dehydrogenase I was found in the B. subtilis genome database. These results allow us to devise a rational metabolic engineering strategy to improve riboflavin production. The potential influence of increased energy coupling in oxidative phosphorylation on riboflavin yield is discussed. Higher coupling is most significant under carbon-limiting conditions in slow-growing cells, that is, in fed-batch processes of industrial interest.     

Transketolase mutation in riboflavin-synthesizing strains of Bacillus subtilis

Unlike its predecessors B. subtilis rosR and 41, riboflavin producing B. subtilis 24 strain does not utilize pentose and gluconate and poorly assimilates glucose. Simultaneous addition of glutamic and shikimic acid restored its capacity to grow and produce riboflavin in medium with pentose and gluconate. This strain lacks the activity of transketolase, the key enzyme of the pentose phosphate cycle, and possesses normal ribulose-5-phosphate-epimerase and glucose phosphate isomerase activities. Like enterobacteria, B. subtilis has two different transport systems for glucose and mannose. The data are discussed from the viewpoint of increasing riboflavin production by transketolase mutants. Probable consequences of cell wall and cytoplasmatic membrane damage in B. subtilis with this mutation are discussed.     

核黄素基因工程研究进展

核黄素 (维生素B2 )为天然水溶性的B族维生素 ,是维持机体正常代谢所必须的物质 ,具有重要的生理功能。目前核黄素的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。其中微生物发酵法是后来发展起来的一种十分经济有效的方法 ,并在核黄素主产中开始占据主导地位。为进一步获得核黄素高产菌株 ,人们对核黄素合成基因及其表达调控的机制做了深入细致的研究 ,并以此为依据 ,通过基因工程手段构建出了核黄素高产菌株 ,大大提高了核黄素的产量 ,其中尤以枯草芽孢杆菌最为成功。综述发酵法生产核黄素的现状、核黄素生物合成的分子生物学以及基因工程研究进展 ,讨论了其进一步的发展方向。     

枯草芽孢杆菌ccpA基因敲除及对其核黄素产量的影响

CcpA蛋白是介导枯草芽孢杆菌碳分解代谢物阻遏(CCR)的全局调控因子,由ccpA基因编码。CCR效应的存在影响B.subtilis对葡萄糖的利用,降低B.subtilis生产发酵产品的效率。采用基因重组技术敲除了核黄素发酵菌株B.subtilis24/pMX45的ccpA基因,构建了CcpA缺陷株B.subtilis24A1/pMX45。发酵结果显示:B.subtilis24A1/pMX45能够在70h内基本耗尽10%的葡萄糖,生物量达到1.5×109个细胞/mL,溢流代谢产物积累量减少,在8%和10%葡萄糖浓度下,B.subtilis24A1/pMX45核黄素产量分别比B.subtilis24/pMX45提高了62%和95%。CcpA的缺陷,可以缓解葡萄糖引起的CCR效应,显著提高菌株的核黄素产量。     

Characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae riboflavin biosynthesis genes.

In this paper, we report the identification, cloning, and complete nucleotide sequence of four genes from Actinobacillus pleuropneumoniae that are involved in riboflavin biosynthesis. The cloned genes can specify production of large amounts of riboflavin in Escherichia coli, can complement several defined genetic mutations in riboflavin biosynthesis in E. coli, and are homologous to riboflavin biosynthetic genes from E. coli, Haemophilus influenzae, and Bacillus subtilis. The genes have been designated A. pleuropneumoniae ribGBAH because of their similarity in both sequence and arrangement to the B. subtilis ribGBAH operon.     

Stoichiometric growth model for riboflavin-producing Bacillus subtilis

Rate equations for measured extracellular rates and macromolecular composition data were combined with a stoichiometric model to describe riboflavin production with an industrial Bacillus subtilis strain using errors in variables regression analysis. On the basis of this combined stoichiometric growth model, we explored the topological features of the B. subtilis metabolic reaction network that was assembled from a large amount of literature. More specifically, we simulated maximum theoretical yields of biomass and riboflavin, including the associated flux regimes. Based on the developed model, the importance of experimental data on building block requirements for maximum yield and flux calculations were investigated. These analyses clearly show that verification of macromolecular composition data is important for optimum flux calculations.