苜蓿中华根瘤菌代谢组学样品制备方法的研究

代谢组样品制备是代谢组学研究的基础。本文以维生素B12生产菌株苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 320为研究对象,通过检测细胞损伤、ATP泄漏、代谢物回收效率以及细胞代谢淬灭效率综合评价细胞淬灭方法,同时对5种提取试剂的提取效率进行比较优化胞内代谢物的提取方法。最终获得苜蓿中华根瘤菌S.meliloti 320的胞内代谢组学样品制备较佳条件:即-20℃40%甲醇淬灭细胞,过滤收集淬灭细胞,甲醇/乙腈/水(体积比为2∶2∶2,外加0.1%的甲酸)与50%甲醇相结合提取胞内代谢物。实验结果显示-20℃的40%甲醇(通过过滤收集细胞)对细胞膜的损伤较小,且细胞代谢淬灭效率和回收效率较高;甲醇/乙腈/水(体积比为2∶2∶2,外加0.1%的甲酸)与50%的甲醇对胞内代谢物的提取效率较高且有互补作用。     

不同来源的尿卟啉原Ⅲ转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B_(12)的影响

S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖型尿卟啉原Ⅲ转甲基酶(S-adenosy-L-methionine uroprophyrinogen Ⅲ methyltransferase,SUMT)催化尿卟啉原Ⅲ(uroprophyrinogen Ⅲ,urogen Ⅲ)中心碳原子C-2和C-7甲基化生成前咕啉-2,是维生素B_(12)生物合成途径中的一步关键酶。本文分别克隆了荚膜红细菌来源的RCcob A1,RCcob A2和脱氮假单胞菌来源的PDcob A,并在VB_(12)生产菌株脱氮假单胞菌中过表达和发酵。通过对三株重组菌维生素B_(12)发酵结果分析可知,SUMT(PDcob A),SUMT1(RCcob A1)和SUMT2(RCcob A2)的表达有利于维生素B_(12)产量的提高,与对照菌株相比分别提高了16.48%,10.2%和31.86%。根据摇瓶发酵的结果在5 L发酵罐上进行了放大实验,p BBR122-PblaRCcob A2的产量为144.5 mg/L,相比对照菌p BBR122-Pbla(111.3 mg/L)产量提高了29.83%左右。结论:SUMT的表达可以在一定程度上解除维生素B_(12)合成途径中的瓶颈,提高维生素B_(12)产量。     

毒素蛋白基因mazF在基因修饰系统中的应用进展

毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA系统)存在于大部分细菌中。mazEF是大肠杆菌中一种毒素-抗毒素系统。毒素基因mazF编码的MazF毒素蛋白可以特异性地剪切自由mRNA的ACA序列,从而抑制蛋白合成、引起细胞生长停滞;近些年,许多学者利用mazF基因作为反向筛选标记对不同种微生物建立了无标记或无痕的基因修饰系统,并实现了不同菌株的基因组修饰。主要综述了大肠杆菌mazF基因作为反向筛选基因的应用原理及其在不同种类微生物的基因修饰系统中的应用进展,然后对mazF基因及其他毒素基因在基因修饰系统中的应用进行了展望。     

L-丝氨酸检测技术的研究进展

L-丝氨酸作为一种非必需氨基酸,它在药物、化工产品以及食品等方面得到了广泛应用,是一种重要的工业产物,具有很重要的研究价值。快速、准确、高通量的检测L-丝氨酸含量的方法,能够为高通量菌种选育提供坚实的基础。本文介绍了目前检测L-丝氨酸含量的多种方法,包括变色酸-分光光度法、纸层析-分光光度法、荧光猝灭法、茚三酮显色法、高效液相色谱法、酶反应检测法及毛细管电泳-电致化学发光( CE-ECL)法,同时通过比较它们的优缺点,并针对L-丝氨酸检测中存在的各种问题进行讨论分析,对L-丝氨酸的检测技术进行展望。     

通过信号肽筛选优化耐高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌

以大肠-枯草穿梭载体p MA5质粒为基本骨架,以来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus NUB3621的耐高温α-淀粉酶基因为目标基因,利用POE-PCR法,成功构建针对淀粉酶的信号肽筛选载体。从枯草芽孢杆菌168基因组中扩增得到46个信号肽,利用POE-PCR法,使46个信号肽分别与线性化的筛选载体形成对应的multimer产物,直接转化枯草芽孢杆菌1A751,得到含不同信号肽的重组菌株。发酵结果显示,除了5个与淀粉酶适配性很低的信号肽,其它信号肽均有不同的引导淀粉酶细胞外分泌的能力,其中bgls引导淀粉酶细胞外分泌的能力最强,上清酶活的峰值达1 393.3 U/m L。     

双组份转运系统BrnFE的过表达和表面活性剂的添加对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸的影响

为了提高L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum LD320的产酸水平,通过改善其分泌系统,在C. glutamicum LD320中分别过表达突变型和野生型的双组份转运系统BrnFE操纵子,构建了重组菌LD320/pXMJ19-brnFE和LD320/pXMJ19-brnFE1。通过对两株重组菌的L-异亮氨酸生产分析比较,发现突变型比野生型能更有效地提高 L-异亮氨酸产量。同时对 LD320/pXMJ19-brnFE1进行表面活性剂添加实验,发现Tween-80为最佳选择,其最佳添加量为0.5 g/L,最佳添加时间为对数期的16 h。最后通过7 L发酵罐放大实验,LD320/pXMJ19-brnFE1的L-异亮氨酸产量由18.53 g/L提高到25.45 g/L,比对照组提高了37%。     

CRISPR/dCas9在苜蓿中华根瘤菌中的建立与应用

本文探讨了CRISPR/dCas9系统对苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 320内源hemE基因的弱化效果,以提高其维生素B_(12)的能力。实验首先验证了CRISPR/dCas9系统及CRISPR/dCas9系统不同N20靶向位点在S.meliloti 320中对外源基因gfp的弱化效果。结果显示,当添加诱导剂1%木糖时,单位OD荧光值降低为对照菌株的34.18%,当N20靶位靠近翻译起始位点时,对结构基因弱化效果明显。进一步探究CRISPR/dCas9对S.meliloti 320中内源的弱化效果发现,在加入终浓度为1%木糖诱导后,hemE基因的转录水平与对照相比下降了28.3%。将hemE基因弱化后的工程菌进行摇瓶发酵,其维生素B_(12)产量较对照株提高了9.86%。研究结果显示,hemE基因的弱化有效促进了代谢流引向维生素B_(12)合成,CRISPR/dCas9系统对S.meliloti 320内源结构基因具有较好的弱化效果。     

荚膜红细菌尿卟啉原Ⅲ转甲基酶的纯化及其酶学性质

S-腺苷-_L-甲硫氨酸依赖型尿卟啉原Ⅲ转甲基酶(S-adenosy-_L-methionine uroprophyrinogenⅢmethyltransferase,SUMT)催化尿卟啉原Ⅲ(UroprophyrinogenⅢ,urogenⅢ)的中心碳原子C-2和C-7位上甲基化生成前咕啉-2,是维生素B12生物合成途径中的一步关键酶,但大部分SUMT受其底物urogenⅢ和副产物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosy-_L-homocysteine,SAH)的抑制作用。为了挖掘能耐受高浓度urogenⅢ的转甲基酶,文中从荚膜红细菌Rhodobacter capsulatus SB1003中克隆2个SUMT基因(RCcobA1,RCcobA2),经表达与纯化后,检测发现RCcobA1和RCcobA2的酶活分别为27.3 U/mg和68.9 U/mg,后者比VB_(12)工业生产菌株脱氮假单胞菌Pseudomonas denitrificans中内源的SUMT(PDcob A,27.9 U/mg)高2.4倍,并且当urogenⅢ浓度高达70μmol/L时都几乎不受抑制作用。因此,RCcobA2的发现可以为解除VB_(12)合成途径的瓶颈以及提高VB_(12)产量提供理论支持和方向指导。