细菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的诱导型异源表达

【目的】实现地衣芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效异源表达,并研究该重组酶的酶学性质。【方法】克隆巨大芽孢杆菌木糖异构酶基因的启动子区域及其调控蛋白,构建一个大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭型诱导表达质粒,使用该诱导型启动子介导麦芽糖淀粉酶编码基因,实现其在枯草芽孢杆菌中的功能表达。对重组枯草芽孢杆菌的诱导条件进行优化,提高麦芽糖淀粉酶的产量。【结果】获得了诱导表达麦芽糖淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。最适诱导温度为45°C,最适诱导剂添加浓度为1%,最适添加诱导剂时间为接种培养9 h后。重组酶蛋白分子量大小为67 k D,对该酶的酶学性质研究发现,以可溶性淀粉为底物,反应生成麦芽糖和葡萄糖,其中麦芽糖含量为60.42%。重组酶最适作用温度为45°C,最适作用p H为6.5,Ca2+、Co2+、EDTA对该重组麦芽糖淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统可以实现麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导型表达,酶活最高可达296.64 U/m L发酵液,在工业上有着较好的应用前景。     

磷脂酰丝氨酸合成酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的表达

应用 PCR技术从 Escherichia coli K12 Sgal- (ExPASy P23830) 中扩增到大小为 1350bp编码磷脂酰丝氨酸合成酶的 DNA片段,将其插入枯草芽孢杆菌诱导型表达载体 pBES,获得重组质粒 pBES-pss后转化 Bacillus subtilis DB104。经蔗糖诱导后,该磷脂酰丝氨酸合成酶在 Bacillus subtilis DB104 (pBES-pss)中获得胞外分泌表达,SDS-PAGE分析发现目的蛋白分子量约为 52kDa,酶联比色法检测酶活力为 1.50U/mL,提高了磷脂酰丝氨酸合成酶的表达产量,为工业化发酵生产磷脂酰丝氨酸合成酶奠定了良好的基础。     

葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵条件优化

为了研究葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中异源表达,笔者从枯草芽孢杆菌中克隆得到带有自身信号肽的葡萄糖醛酸木聚糖酶基因,将其构建到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒中,转化入枯草芽孢杆菌WB800,得到重组菌。通过发酵条件以及培养基成分优化,重组菌中葡萄糖醛酸木聚糖酶酶活达到76.0 U/mL,约为优化前产酶量的5.4倍。葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中实现高效异源表达,为其进一步的实际应用奠定了基础。     

基于麦芽糖诱导型启动子在枯草芽胞杆菌中异源表达麦芽四糖淀粉酶及其酶学性质的研究

麦芽四糖淀粉酶(Maltotetraose amylase, Mta)可以从淀粉的非还原末端特异性依次切割第4个α-1,4糖苷键形成麦芽四糖,目前在食品、医疗保健和造纸等领域具有重要应用。构建安全、高效的表达系统强化麦芽四糖淀粉酶的重组表达,进而降低以其为核心酶的麦芽四糖生物转化过程的生产成本具有迫切的现实需求。本研究将源自Pseudomonas saccharophila(DSM 654)的麦芽四糖淀粉酶基因mta在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中重组表达,利用麦芽糖诱导型启动子实现其安全高效表达,之后对重组酶进行分离纯化和酶学性质表征。结果显示,将携带麦芽糖诱导型启动子P_glv的表达载体转入B.subtilis WB800N中,成功构建工程菌后进行诱导表达,并且利用金属离子螯合层析技术成功获得了Mta纯酶。酶学性质研究结果显示其最适反应温度为55℃,最适反应pH为7.5。动力学常数K_m为(1.26±0.17) g/L、k_cat/K_m为(2 275.07±32.83) L/s·g,...     

碱性β-甘露聚糖酶基因异源表达的研究

亚克隆的碱性β-甘露聚糖酶基因(man)来源于嗜碱芽孢杆菌N16-5,构建了大肠杆菌-枯草芽孢杆菌诱导型表达质粒pDG-man,在大肠杆菌JM109中获得了活性表达,经0.5 mmol/L的IPTG诱导后,可表达5 U/mL碱性β-甘露聚糖酶。重组大肠杆菌DE3-RIL(pDG-man)表达β-甘露聚糖酶水平是大肠杆菌JM109(pDG-man)的2倍。重组枯草芽孢杆菌WB600(pDG-man)可表达19.2 U/mL碱性β-甘露聚糖酶。     

在枯草杆菌芽胞表面展示P74蛋白膜外肽段

目的:对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)囊膜蛋白P74膜外肽段与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)CotC与进行融合表达,制备表面展示有P74蛋白的重组芽孢,为深入研究该重组芽孢的功能提供基础.方法:将CotC基因与BmNPV P74膜外编码序列进行融合,构建表达CotC-P74融合蛋白的重组质粒pJS700-p74.通过双交换使该重组质粒中的CotC-P74表达盒整合到枯草芽胞杆菌染色体淀粉酶基因位点,并对发生同源重组后的菌株进行筛选和PCR鉴定.结果:PCR结果表明CotC-P74成功地整合到枯草芽孢杆菌基因组上,通过作者实验室制备的P74多抗对诱导后的重组芽孢衣壳总蛋白进行Western blot分析,结果在49 kDa位置处能杂交到一条特异的蛋白带.结论:P74蛋白胞外肽段成功地展示在枯草芽胞杆菌芽胞表面.     

巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中诱导表达及碳代谢去阻遏

【背景】β-淀粉酶在食品和医疗领域应用广泛。目前工业上使用的β-淀粉酶主要从植物中提取,生产成本高,限制了β-淀粉酶的应用。微生物生产的β-淀粉酶尽管早有报道,但由于产酶水平低下,因而一直未能实现工业化。【目的】实现巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导表达,缓解碳分解代谢物阻遏(Carbon catabolite repression,CCR)对该重组酶表达的影响,并研究其酶学性质。【方法】克隆枯草芽孢杆菌木糖诱导启动子,构建木糖诱导表达载体以介导巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶编码基因amyM在枯草芽孢杆菌中的异源表达。定点突变位于amyM信号肽编码区的分解代谢物响应元件(Catabolite responsive element,CRE),降低碳源代谢对重组β-淀粉酶施加的阻遏。【结果】构建了诱导表达β-淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。同义替换amyM-CRE保守碱基在不同程度上缓解了碳源所施加的CCR效应,重组酶的表达水平得到显著提高。重组酶的分子量为57 kD,水解可溶性淀粉主要生成麦芽糖和少量葡萄糖,其中麦芽糖含量为72%。该酶最适作用温度为50°C,最适反应pH为6.0。Co2+、Ca2+对重组β-淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统和碳代谢去阻遏实现了β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达,酶活最高可达97.16 U/mL发酵液,比amyM基因来源菌巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶产量提高了440倍,为β-淀粉酶发酵生产的工业化提供了支撑。     

Cry1Ac基因载体构建及其在枯草芽孢杆菌中的杀虫活性表达

根据苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HD-73基因Cry1Ac和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis木糖诱导型启动子PxylR序列, 分别设计2对特异引物Cry1Ac F/R和Pxy F/R,扩增获得了完整的启动子PxylR和Cry1Ac基因序列,进一步以上述产物混合物为模板,以Pxy F/Cry1Ac R作引物进行重迭PCR,获得了载体PxylR-Cry1Ac,经SphⅠ和BamHⅠ完全酶切后,将PxylR-Cry1Ac插入大肠杆菌-苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315,重组表达质粒pCry1Ac315转化枯草芽孢杆菌感受态细胞。工程菌株质粒酶切电泳分析、SDS-PAGE电泳分析和杀虫生物活性测定结果证实了Cry1Ac基因的导入及其在枯草芽孢杆菌JAAS01D中的有效表达。     

产木聚糖酶枯草芽孢杆菌构建及表达条件优化

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有很强的分泌能力,产酶能力强,属于食品级安全微生物.以枯草芽孢杆菌为宿主菌异源表达木聚糖酶,采用同源重组的方法将木聚糖酶基因连接到载体pWB980上,构建表达载体pWB980-xynZF-2,电击转化枯草芽孢杆菌WB600,获得重组工程菌WB600-pWB980-xynZF-2.对重组工程菌进行单因素发酵条件优化和正交试验.结果表明:重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵的最适接种量1％、种龄14 h、装液量50 mL、温度34℃,转速160 r/min、发酵时间192 h.在摇瓶发酵条件下,木聚糖酶产量可达到0.168 U/mL.     

外源木聚糖酶在枯草芽胞杆菌中信号肽筛选

[目的]本试验旨在筛选引导表达外源木聚糖酶基因高效分泌的信号肽,为枯草芽胞杆菌木聚糖酶高效分泌表达系统提供元件.[方法]构建信号肽筛选载体,载体是以含壮观霉素抗性基因的大肠-枯草穿梭载体为基本骨架,目标蛋白为耐碱性木聚糖酶,可在麦芽糖启动子Pglv诱导下表达.从枯草芽胞杆菌A1747基因组中扩增获得24个Sec途径信号肽,并将其全部链接到至筛选载体上,并在枯草芽胞杆菌WB700中实现表达分泌.重组菌在3%麦芽糖诱导下培养24h后用DNS法测定上清酶活.[结果]成功构建信号肽筛选载体pGPSX及24个表达载体,实现木聚糖酶表达分泌.且不同信号肽对于引导外源木聚糖酶分泌能力不同,其中YnfF信号肽引导分泌目标蛋白效率最高,上清酶活为37.2IU/mL.[结论]试验证明在枯草杆菌中对外源蛋白进行信号肽筛选是提高其分泌的有效途径,并获得了针对木聚糖酶高效分泌信号肽YnfF.     

蛋白激发子PeaT1在枯草芽胞杆菌中的分泌表达及重组菌株提高小麦抗旱和促生的作用

PeaT1是从极细链格孢菌Alternaria tenuissima中分离的一种蛋白激发子,具有促进植物生长和诱导植物产生系统获得抗性的功能,为了实现peaT1基因在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中的分泌表达,增加其应用途径,从枯草芽胞杆菌基因组DNA中分别扩增获得P43启动子和nprB基因的信号肽序列,并用SOE (Splicing by over lapping extension) 方法与peaT1基因连接,将连接产物克隆到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭表达载体pHY300-PLK上,构建了重组表达载体pHY43N-peaT1。将重组载体转化枯草芽胞杆菌WB800菌株,SDS-PAGE和Western blotting分析证实,在NprB信号肽的引导下,枯草芽胞杆菌成功分泌表达了PeaT1蛋白。构建的重组菌株能够显著增强幼苗抗旱性,提高小麦株高。     

海参溶菌酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的整合及表达

采用枯草芽孢杆菌WB600(Bacillus subtilis WB600)在体外表达海刺参溶菌酶(Stichopus japonicus lysozyme,SjLys)蛋白。通过构建克隆质粒pMD18-P43-SjLys,将B.subtilis自身强启动子P43序列和已分离得到的SjLys基因(GenBank登录号EF036468)连接(P43-SjLys)。经BamH I/EcoR I酶切,将P43-SjLys片段连接到B.subtilis整合载体pDG1730上,构建整合重组质粒pDG-P43-SjLys。经Xho I酶切处理,线性化的pDG-P43-SjLys质粒转化B.subtilis WB600细胞。P43-SjLys片段通过同源双交换重组整合到B.subtilis WB600染色体上,成功得到具有稳定遗传的基因工程菌B.subtilis WB600/P43-SjLys。经SDS-PAGE和抑菌试验分析表明,培养60 h后,B.subtilis WB600/P43-SjLys能够表达可溶的,对常见的海洋细菌溶壁微球菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性的SjLys蛋白。首次在B.subtilis表达系统中得到可溶且具有酶活功能的SjLys蛋白,为SjLys的生产提出了一种具有可行性的和潜力的新方法。     

不同信号肽及分子伴侣对中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达的影响

通过筛选5个不同的信号肽基因(AmyE、AprE、NprE、SacB、YncM)代替对照质粒pHT43-npr上原始的信号肽基因,整合2个不同的分子伴侣(PrsA、DnaK)到pHT43-npr质粒上,构建重组质粒并转化到枯草芽孢杆菌WB800N中进行诱导表达。结果表明,构建了5株信号肽重组菌株,通过牛奶平板验证无明显水解圈,通过酶活性比较,5株重组菌株中性蛋白酶活性均显著低于对照菌株;成功构建了2株整合分子伴侣的重组菌株,通过牛奶平板验证有水解圈,通过酶活性比较,两株菌株均表达中性蛋白酶,其中重组菌株WB800N/pHT43-npr-PrsA产蛋白酶活性比对照菌株WB800N/pHT43-npr提高了23%,重组菌株WB800N/pHT43-npr-DnaK产蛋白酶活性比对照菌株提高了33%。     

重组枯草芽胞杆菌不对称还原产d-伪麻黄碱

为了实现羰基还原酶基因mldh在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中的表达并通过细胞内的葡萄糖脱氢酶完成辅酶的再生,以枯草芽胞杆菌rpsD基因的启动子PrpsD和终止子TrpsD为表达元件,将羰基还原酶基因mldh连接至构建好的质粒(pHY300plk-PrpsD-TrpsD上,得到质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD;进一步将重组质粒转化入B. subtilis Wb600中获得重组菌B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-Trps     

猪圆环病毒衣壳蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达研究

研究猪圆病毒衣壳蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达情况。以3个不同的质粒为基础,构建不同类型的猪圆环病毒衣壳蛋白基因(PCV2-ORF2)重组表达载体,并分别转化进入枯草芽孢杆菌168和WB800中。利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达,并通过实时荧光定量PCR检测目的基因的转录水平上的表达情况。结果显示,ORF2基因原序列在枯草芽孢杆菌中难以表达,经过密码子优化后,构建的截短ORF2基因表达载体在枯草芽孢杆菌内表达系统中成功表达目的蛋白。密码子优化促进了目的基因的表达。     

产单核细胞李斯特菌p60蛋白N端肽聚糖结合基序在枯草芽孢杆菌中的表达

目的:构建产单核细胞李斯特菌胞外蛋白p60的N端肽聚糖结合基序(p60-N)表达载体,实现其在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。方法:将目标基因克隆到表达载体pHT43中获得重组载体pHT43-p60-N,转化枯草芽孢杆菌WB800N获得重组工程菌株WB800N/pHT43-p60-N,在此基础上考察IPTG浓度、培养基、表达时间和温度等条件对目标蛋白表达的影响。结果:p60-N蛋白可在枯草芽孢杆菌中分泌表达,与鼠李糖乳杆菌形成的革兰阳性增强基(GEM)颗粒特异性结合,具有与天然蛋白类似的生物学活性。用GB培养基,在37℃下,加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导12~20 h,表达量提高到28 mg/L。结论:实现了p60蛋白N端基序在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,为进一步研究以该蛋白为基础的细菌样颗粒疫苗奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

利用枯草芽孢杆菌ytkA和ywoF基因启动子与信号肽重组分泌表达mpd基因

用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pNW33N和去除了信号肽编码序列的成熟mpd基因构建了穿梭启动子探针pNW33N-mpd。用该探针从质粒pMPDP3和pMPDP29上克隆来自于枯草芽孢杆菌ytkA和ywoF基因上游的启动子功能片段,构建了穿梭表达载体pNYTM和pNYWM。将表达载体pNYTM和pNYWM转入枯草芽孢杆菌1A751获得表达菌株1A751(pNYTM)和1A751(pNYTM),mpd基因在ytkA和ywoF基因的启动子和信号肽的带动下实现了分泌表达且具有天然活性,结果表明ytkA基因的启动子强度强于ywoF基因的启动子。利用ytkA基因的强启动子和nprB基因的分泌型信号肽编码序列构建了新的穿梭分泌表达载体pYNMK,并使mpd基因在枯草芽孢杆菌WB800中得到了更高水平的分泌表达,表达菌株WB800(pYNMK)在培养到第84h时甲基对硫磷水解酶酶活达到最高值为10.40u/mL,是出发菌株邻单胞菌M6表达量的10.8倍,重组表达产物有91.4%分泌在培养基中。     

以CotC为分子载体在枯草芽孢杆菌表面展示海藻糖合酶

海藻糖是自然界中普遍存在的一种非还原性双糖,是一种极好的天然干燥剂和保鲜剂。海藻糖合酶能够催化α,α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖,是生产海藻糖的首选。为获得具有良好展示效果的海藻糖合酶,将其高效稳定的展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面,实验同时分别选取增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和海藻糖合酶(Tres)作为模型蛋白,以来自枯草芽孢杆菌的芽孢衣壳蛋白Cot C作为枯草芽杆菌表面展示的锚定蛋白进行表面展示研究。利用流式细胞仪分析EGFP在芽孢表面展示的情况,结果表明芽孢衣壳蛋白Cot C可以将EGFP固定在芽孢的表面。然后将荧光蛋白基因egfp通过酶切替换为海藻糖合酶基因tres,将重组菌株使用p H7.5的缓冲液清洗并重悬,与底物浓度为30%的麦芽糖在50℃水浴条件下作用2h,反应产物利用HPLC检测,能够检测到海藻糖峰,通过计算得到的酶活为252U/ml。说明海藻糖合酶基因通过与芽孢衣壳蛋白Cot C融合后可被展示在芽孢的表面。     

重组枯草芽孢杆菌发酵廉价原料生产普鲁兰酶

[目的]构建长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体枯草芽孢杆菌工程菌株,优化发酵条件,筛选廉价的培养基原料生产普鲁兰酶。[方法]利用分子生物学手段,将基因pul324和表达载体p WB980连接,构建表达质粒p WB-pul324并转化Bacillus subtilis WB600;对表达产物进行SDS-PAGE分析和初始酶活的测定。进一步优化发酵条件,对不同碳源和氮源进行发酵培养基的筛选,同时研究不同金属离子的添加和培养基初始p H、接种量对发酵产酶的影响。[结果]获得基因工程菌B.subtilis WB600/p WB-pul324,SDS-PAGE电泳结果显示在89 k Da处有特异性条带,发酵初始酶活为12.34 U/ml;筛选得到玉米淀粉水解液和玉米浆干粉为培养基最适碳源和氮源,其最适浓度分别为50 g/L和30 g/L。Mn~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)和Tween-80的添加能提高发酵产酶活力。在最适初始p H 6.5,以最适5%接种量接种于优化后的培养基中,摇瓶发酵80 h普鲁兰酶的酶活达到414.48 U/ml。[结论]实现了普鲁兰酶突变体在枯草芽孢杆菌中的高效表达,筛选获得的培养基主要原料经济低廉,经过发酵条件优化后,重组菌酶活达到414.48 U/ml,是之前研究结果(20.16U/ml)的20倍。