格特隐球菌交配型的多重PCR鉴定

【目的】建立一种基于格特隐球菌α交配型位点内SXI1α基因和a交配型位点内SXI2a基因的多重PCR分析,用于快速鉴定格特隐球菌的交配型。【方法】设计针对格特隐球菌α交配型位点内SXI1α基因部分片段和格特隐球菌a交配型位点内SXI2a基因部分片段的特异性引物,用于多重PCR鉴定格特隐球菌的交配型;并与交配试验以及已报道的扩增α交配型位点的引物MFα、STE12α,及扩增a交配型位点的引物STE20a、STE3a进行扩增效果的比较。【结果】基于SXI1α基因和SXI2a基因的多重PCR分析,准确鉴定所有受试格特隐球菌(包括VGI、VGII、VGIII和VGIV基因型)的交配型,引物STE12α、STE20a和STE3a在常规PCR鉴定中不能鉴定部分菌株的交配型;66.7%的受试菌株不能发生交配,交配试验无法鉴定其交配型。【结论】建立的多重PCR方法明显优于常规PCR或交配试验鉴定。     

梅花类黄酮3''-羟化酶基因片段基于基因组DNA的简并PCR法克隆

用本研究设计的"预先去杂-SDS法"从梅花嫩叶提取到高质量的基因组DNA.根据11条已公开发表的并提交到GenBank的类黄酮3'-羟化酶基因cDNA的假定氨基酸序列的保守区设计2个正向简并引物和3个反向简并引物组成6对引物,仅有1对引物能以PCR法同时从梅花'南京红须'、'南京红'和'粉皮宫粉'的基因组DNA扩增到一个469 bp的核苷酸片段,这3个片段在总体上有99.72%的一致性,与11条类黄酮3'-羟化酶基因cDNA的相应区域有65.57%的一致性.同时,"GGEK"并非类黄酮3'-羟化酶的特征性模体.这是首次从木本植物的基因组DNA克隆到类黄酮3'-羟化酶基因片段.本研究结果可为梅花类黄酮3'-羟化酶基因全长的克隆奠定基础.     

一种单核苷酸多态性的单倍型分析技术

运用多步PCR和测序技术,完成基因组中相距较远的单核苷酸多态位点的单倍型构建。通过设计2条等位基因特异性引物,扩增大片段DNA(10kb左右),以此大片段DNA作为下一轮PCR反应的模板,再在该片段中设计待检测区域的PCR引物,进行第2轮PCR。对PCR产物进行测序分析,确定其多态位点处的等位基因。结合第1轮PCR中的等位基因特异性引物,即可确定该大片段DNA中不同单核苷酸多态性构成的单倍型。以脂蛋白脂酶基因为例,应用其启动子区以及第4外显子区的等位基因特异性引物扩增约16kb的DNA片段,然后检测位于该片段中第2、3外显子的多态性。在￡-尸￡-基因第2内含子中发现了 13557G→A多态性。经分析确定出-421G／ 13557G／ 15222A、-421A／ 13557G／ 15222A、-421G／ 13557G／ 15222G、-421G／ 13557A／ 15222A等4种单倍型。等位基因特异性PCR结合小片段测序是一种快捷高效的对相距较远的多个SNP进行单倍型构建的新策略。     

基于荧光定量PCR扩增反应的SNP测定法

建立一种利用荧光定量PCR扩增反应进行单核苷酸多态性(SNP)快速测定的方法.以人β肾上腺素受体2基因中的Arg16Gly为研究对象,利用荧光染料SYBRGreenⅠ标记定量PCR产物,通过PCR生长曲线和融解曲线分析结果进行SNP分型.为提高SNP测定的特异性,分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物3′端倒数第3个碱基位置,引入了一个人为错配碱基,使引物的错误延伸率显著降低,大大提高了SNP分析的准确性.通过DNA测序验证荧光定量PCR对β肾上腺素受体2基因中Arg16Gly分型结果的准确率.实验结果表明,所建立的方法操作简便,结果准确,适合进行大规模样品的SNP检测工作.     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立FcγR基因大片段敲除小鼠模型

目的使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除长度约为90 kb的小鼠FcγR2b,FcγR3,FcγR4基因簇,为构建FcγR基因人源化小鼠奠定基础。方法使用在线预测软件在FcγR2b,FcγR3外显子区设计sgRNA,在每一位点挑选脱靶效应较低的五个候选sgRNA。通过CRISPR/Cas9活性检测试剂盒检测sgRNA在体外的活性。选取活性较高的sgRNA体外转录,与Cas9 mRNA一并注射受精卵。通过PCR检测及测序,得到1只敲除片段为89 711 bp的基因修饰小鼠,且同时敲除FcγR2b基因5’端,FcγR3基因3’端及FcγR4基因。而且还利用软件预测了8个脱靶可能性最高的位点,并对首建鼠基因组的上述8个脱靶位点全部测序确认。结果结果显示未在预测脱靶位点附近发现小片段插入或缺失。结论建立了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因组超大片段的技术,该技术结合BAC转基因技术,将为建立含有复杂基因族的人源化小鼠提供新的途径。     

Atp11c基因诱捕小鼠遗传背景分析

目的利用PCR(polymerase chain reaction,PCR)和荧光竞争性PCR技术对构建的Atp11c基因诱捕小鼠的遗传背景进行分析。方法通过PCR技术鉴定基因诱捕载体的插入位点和宿主染色体的缺失状态;利用荧光竞争性PCR技术检测宿主染色体内的诱捕载体拷贝数。结果 54对引物的PCR结果确定了诱捕载体在Atp11c第一个内含子中的插入位点,测序结果显示伴随着基因诱捕载体两端大于200 bp的碱基缺失,宿主染色体片段出现了418 bp的碱基删除;荧光竞争性PCR证实诱捕载体为单拷贝整合。结论成功解析了Atp11c基因诱捕小鼠的遗传背景,建立了快速、准确检测诱捕小鼠遗传背景的方案。     

黑腹果蝇黑条体突变体突变位点的鉴定

根据果蝇ebony基因的序列设计了一系列特异性引物,对1991年发现的一种黑腹果蝇的新的体色突变（Qian＆Zhang,1994）——黑条体突变型的ebony基因进行克隆和序列测定。与野生型W91910的ebony基因相比,黑条体突变型的ebony基因的编码区无明显的大片段变异,变异仅存在于数个氨基酸位点,且均不位于该基因产物的关键序列。在黑条体的ebony基因的5’端序列的克隆和序列测定中发现,与野生型w^91910及黑檀体e。的ebony基因相比,黑条体突变型的ebony基因有一个大片段的缺失,该缺失包括外显子1的206个碱基和内含子1的747个碱基,由此确定了黑条体突变体的突变类型和突变位点。     

四引物扩增受阻突变体系PCR快速测定绵羊 BMPR-IB基因型方法的建立

四引物ARMS PCR是检测SNP有效、快速、简便的方法.绵羊BMPR-lB基因是控制Booroola绵羊多胎性状的主效基因,此研究目的在于建立一种对BMPR-IB基因四引物ARMS PCR检测方法.根据四引物ARMS PCR技术原理,在绵羊BMPR-IB基因突变位点(A746G)设计一对特异性引物,并在突变点两侧设计一对参照引物,用来扩增含有突变点的DNA片段,可在一步PCR反应中根据电泳图谱准确判断绵羊个体的BMPR-IB基因型,对比PCR-RFLP检测结果表明,所建立的方法简单,操作简便,大大提高了检测效率.     

高保真酶特异性检测大鼠SNP基因型新方法

目的应用高保真酶（Pfu）和3’末端修饰引物在单管双向等位基因特异性扩增（SB-ASA）中区分SNP基因型,建立高保真酶特异性检测SNP基因型的新方法。方法选取近交系大鼠SNP位点,以RS8149053为例,设计两个外部引物和两个等位基因特异性引物,四引物3’末端进行硫代磷酸化修饰,应用高保真聚合酶（Pfu）进行特异性扩增,扩增结果测序验证其可靠性。结果在RS8149053 SNP位点（C/T）上,等位基因型CC扩增出179 bp目的片段,基因型TT扩增出597 bp目的片段,基因型不同则扩增出分子量不同的片段,目的条带测序结果与Rat Genome Database数据库基因型结果一致,高保真酶扩增结果稳定且特异性强。结论高保真酶等位基因特异性扩增技术能有效降低假阳性率,是一种快速、特异的SNP基因分型新方法。     

多重等位基因特异性扩增—— 微流控芯片电泳法同时测定多个单核苷酸多态性位点

文章以微流控芯片电泳为检测平台, 建立了一种基于DNA适配器连接介导的多重等位基因特异性扩增同时测定多个单核苷酸多态性(SNP)位点的方法。以白细胞介素1β(IL1B)基因中的7个SNP位点(794C>T、1274C>T、2143T>C、2766T>del、3298G>A、5200G>A和5277C>T)为检测对象, 通过PCR预扩增得一段含该7个待测SNP位点的长片段; 用限制性内切酶MboⅠ将其消化成短片段, 再与DNA适配器(adapter)相连; 以连接产物为模板, 在两管中分别用7条等位基因特异性引物和一条公用引物进行7重等位基因特异性扩增; 最后用微流控芯片电泳法分离等位基因特异性扩增产物, 根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。采用本法成功测定了48名健康中国人的IL1B基因上的7个SNP位点, 与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)和测序法测定结果完全一致。本法结果准确, 可用于同时测定多个SNP位点; 以微流控芯片电泳作为检测平台, 分析速度快, 样品需要量少; 借助于自制筛分凝胶和重复使用芯片, 使得SNP分析成本大大降低。     

小鼠基因功能研究及疾病模型系列专题(二)——基因工程小鼠的品系管理及基因型鉴定

<正>实验室基因工程小鼠品系的保存大多是通过和野生型小鼠交配,然后不断鉴定、选择携带基因突变或转基因的后代来实现。因此,维持一个基因工程小鼠品系,必须要通过分子生物学手段不断的鉴定小鼠的基因型。以基因剔除小鼠为例,一般我们需要设计两组不同的PCR引物,分别用于扩增野生型小鼠和突变型小鼠的基因组DNA片段。用于扩增野生型基因组DNA的PCR两个引物至少有一个来自于被剔除的区域DNA序列,这样对于基因剔除小鼠纯合子个体基因组DNA,利用这对引物将无法得到扩增产物;用于扩增突变型小鼠基因组DNA,我们一般在被     

基于焦磷酸测序技术建立基因编辑水稻检测方法

基因编辑技术发展迅速,但对应的检测方法较少。为寻找创建基因编辑作物适用的检测方法,以 PL3 基因编辑水稻编辑位点为靶标,有效设计了焦磷酸测序的扩增引物及测序引物,并进行有效性检测,分别利用Sequence to Analyze等程序以及SNP和AQ两种模式完成了对PL3 基因的定性和定量检测试验,建立了 PL3 基因编辑水稻编辑位点焦磷酸测序检测方法。结果表明,基于焦磷酸测序技术可以通过检测编辑位点从而将基因编辑型水稻与野生型水稻进行区分。与常规的转基因检测方法相比,该检测方法具有较好的准确性、高效性及高灵敏度等优点,在基因编辑型水稻编辑位点定性和定量检测分析方面具有很好的应用前景。     

等位基因特异PCR技术的研究与应用

生物的单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism,SNP)具有数量多、分布广、易于分型、稳定性强等优点,很适合于用做分子标记.等位基因特异PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)是根据SNP位点设计3'末端与SNP位点碱基互补或错配的特异PCR引物,通过凝胶电泳等方法检测PCR扩增产物的有或无,从而检测基因型中SNP的一种技术.经过不断地改进与完善,基于SNP的等位基因特异PCR标记已逐渐成为一种快速、简便、低成本、可靠、高通量的检测基因型SNP的方法.本文应用等位基因特异PCR技术,根据小麦TaDREB1基因在旱选10和鲁麦14的120(C→A)SNP成功地开发了一个SNP分子标记,证明了该方法的有效性和可行性.     

MC1R基因多态性与豚鼠隐性黄毛色的相关性分析

豚鼠Cavia porcellus的隐性黄毛色表型是由编码黑素皮质激素受体1(MC1R)的extension基因座位的等位基因e控制。本研究对野生型和黄毛色豚鼠MC1R基因位点所在区域进行PCR扩增与测序发现,在黄毛色豚鼠中存在1个2 760 bp的基因组缺失,该缺失涵盖了MC1R基因的整个编码区。采用三引物扩增体系对豚鼠MC1R基因缺失突变进行群体基因分型,在随机选择的58只野生型个体中,36只为EE纯合子,22只为Ee杂合子,而31只黄毛色个体均为ee纯合子;在15只测交后代中,8只黄毛色个体均为ee纯合子,而7只野生型个体均为Ee杂合子。基因分型结果表明,MC1R基因2 760 bp的缺失与隐性黄毛色完全相关。本研究为进一步探究MC1R基因在哺乳动物毛色遗传机制中的作用以及豚鼠的分子标记辅助育种提供了理论依据。     

转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的研究

主要采用了绝对定量PCR和热不均一交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR),检测了体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点,并利用旁侧PCR(Junction PCR)对整合位点进行确定,同时进一步分析了整合位点的纯合性．结果表明,绝对定量PCR可以准确有效地检测外源基因拷贝数,标准曲线为：log₂N (拷贝数) =-0.935 4ΔCt + 3.411 6 (R²=0.997 4,P < 0.001),两只转基因猪中外源基因拷贝数分别为30.85 ± 1.77和18.87 ± 1.34;TAIL-PCR能成功地克隆转基因猪中外源基因整合位点,得到25条特异性条带,经BLAST比对,共获得TgInS1 (1 440 bp)、TgInS2 (1 263 bp)和TgInS3 (1 861 bp) 3个整合位点．以整合位点侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合引发Junction PCR,得到预计大小的特异性片段,确定了整合位点上、下游侧翼序列的准确性．采用整合位点5′上游和3′下游侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合,进行Junction PCR,在两只转基因猪中都得到与野生型猪一致的侧翼序列特异性引物扩增片段,表明我们获得的转基因猪都为整合位点杂合子．初步建立了绝对定量PCR和TAIL-PCR对外源基因拷贝数和整合位点检测的体系,为今后研究外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性打下了基础．     

改进的多片段重叠延伸PCR制作基因多位点突变

为在研究工作中提高制作目标基因多位点突变体的效率,对常规重叠延伸PCR进行适当改进:对于相距较近的两个突变位点,只需设计一对突变引物各自涵盖其中一个位点即可一次突变;对于相距较远的两个位点,可以采用三片段重叠延伸PCR的办法解决;两者结合则可一次性突变多个位点。以制作RBCT的6位点突变体PSM6为例,利用上述策略,设计两对突变引物;采用OE-PCR法,第一轮PCR扩增出三个片段,第二轮PCR同时利用三片段重叠延伸产物作为模板扩增出目标基因突变体,再按常规分子克隆方法将其连入质粒载体。经测序检测,发现得到了预期的目标基因多位点突变体。因此,采用灵活的引物设计策略,结合多片段重叠延伸PCR即可一次性制作基因的多位点突变体,此方案可解决研究工作中大多数多位点突变问题。     

基因重组与基因合成实验设计软件系统的建立

本文报导了用于基因重组与基因合成实验设计的软件系统的建立.此系统由30个功能模块组成,为研究者提供了包括在DNA分子上寻找限制性内切酶位点、核酸分子片段之间同源性比较,基因化学合成的实验设计、特定顺序分析引物及核酸杂交探针的设计、阅读框的查找等功能.此外,本系统可以对外来数据库的资料进行援引和进一步分析,为分子生物学的研究提供有价值的信息.     

基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成中多位点缺失突变的校正方法

目的:建立一种PCR方法,以快速校正基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的多位点缺失突变。方法:用PCR方法合成基孔肯雅病毒非结构蛋白基因;对测序的克隆进行序列比对,分析不同克隆上缺失突变发生的位置,以保守区域互相重叠的寡核苷酸为上下游引物、以该区域测序正确的克隆为模板进行PCR扩增,得到所需片段,再将这些片段用PCR方法进一步组装成完整的基因序列并进行测序。结果:测序结果表明,经过2次PCR扩增,校正了基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的5个位点缺失突变。结论:得到序列正确的基孔肯雅病毒非结构蛋白基因。在进行基因合成过程中如发生多位点缺失突变,可利用该方法同时对以上突变进行校正,无须再合成引物,降低了实验操作难度,并提高了实验效率。     

人肝细胞中FⅧ基因5'端CpG岛甲基化状态的研究

本实验通过建立稳定的重亚硫酸盐测序(bisulfite-sequencing PCR,BSP)检测平台,研究人类永生化肝细胞LO2与人肝组织细胞中凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ,FⅧ)基因5'端Cp G岛的甲基化状态及该Cp G岛的甲基化在FⅧ表达调节中的作用。运用RT-PCR、Western-blot检测FⅧ在LO2细胞与人肝组织中的转录及表达,Methprimer软件预测FⅧ基因5'端Cp G岛并设计BSP引物,BSP联合TA克隆及质粒PCR各验证十个阳性单克隆送测序,QUMA软件对测序结果进行甲基化位点分析,以(甲基化CG位点个数)/(甲基化CG位点个数+非甲基化位点个数)计算甲基化率。结果显示,新鲜分离的人肝组织细胞能够稳定表达FⅧ,LO2细胞不能表达;FⅧ基因5'端存在一个278 bp的Cp G岛,LO2细胞中该Cp G岛的甲基化率为93.48%,正常人肝组织中该Cp G岛的甲基化率为93.91%。本实验成功建立稳定的BSP检测平台,并发现在LO2细胞与人肝组织中,FⅧ基因5'端均存在一个被高度甲基化的Cp G岛,人肝组织中FⅧ基因5'端Cp G岛的甲基化可能参与维持体内FⅧ的低水平表达。     

PCR方法在HSF1基因敲除小鼠基因型分析中的应用

目的　为HSF1基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法　设计两对引物扩增野生型HSF1基因和HSF1缺陷突变基因的DNA片段 ,用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度 ,并将所得基因型结果与经典的Southernblot方法比较。结果　野生型仅在 5 6 2bp处有一条条带 ,突变纯合子仅在 377bp处有一条条带 ,杂合子则在377bp和 5 6 2bp处出现两条条带。用PCR方法获得的HSF1基因分析结果与经典的Southernblot方法获得的结果完全一致。结论　用PCR方法分析HSF1基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点