基于前体供给途径遗传改造提高褐黄孢链霉菌纳他霉素的产量

纳他霉素(natamycin)是一种高效、广谱、安全的抗真菌剂,广泛应用于食品防腐与医药领域。纳他霉素可由多种链霉菌发酵产生。它是以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A及甲基丙二酰辅酶A为前体经Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化合成的多烯大环内酯类化合物。本研究以纳他霉素产生菌——褐黄孢链霉菌为研究材料,分别对不同前体分子供给途径中的关键酶进行过表达,并确定影响纳他霉素产量的关键前体供给途径。研究结果发现：通过过表达乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)加强乙酰辅酶A合成途径,以及通过过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)加强甲基丙二酰辅酶A合成途径,重组菌株纳他霉素产量分别比野生型菌株提高了44.19%和20.51%。共过表达ACS和MCM,重组菌株纳他霉素产量获得进一步提升(达1123.34mg/L),比野生型菌株提高了66.29%。上述发现为通过前体代谢工程的策略构建纳他霉素工业高产菌株提供了参考,也为其他聚酮类天然产物高产工程菌株的构建提供了借鉴。     

微生物合成丙二酰辅酶A衍生物的代谢工程

丙二酰辅酶A是一种重要的微生物胞内代谢中间产物,由于其独特的结构,可衍生为几类具有独特结构的化合物,包括:脂肪酸类化合物、生物基化学品和植物源黄酮及聚酮类天然产物等。这些化合物广泛应用于食品、医药、化工和能源等领域。目前,微生物大量合成上述丙二酰辅酶A衍生物的限制性因素是其胞内较低的丙二酰辅酶A含量。本文中,笔者以提高微生物合成丙二酰辅酶A衍生物为核心,综述了提高其前体丙二酰辅酶A导向目标产物的代谢工程策略,包括丙二酰辅酶A合成途径的强化、竞争支路途径的消减以及其含量的精细调控等,以期为微生物合成丙二酰辅酶A衍生物的进一步研究提供参考。     

热稳定酯酰辅酶A合成酶的异源表达及酶学特性

【目的】为寻找能合成丙酰辅酶A和丁酰辅酶A等聚酮合成前体的生物催化剂,用体外酶学实验对一个酯酰辅酶A合成酶进行了表征。【方法】利用丙二酰辅酶A合成酶作为输入序列,通过BLAST程序在Caldicellulosiruptor owensensis OL的基因组中找到1个酯酰辅酶A合成酶基因。在大肠杆菌中进行了异源表达,并通过亲和层析进行纯化。底物谱、最适反应条件、稳定性和动力学参数通过体外酶学实验进行表征,而定点突变则用于活性中心的氨基酸残基的分析。【结果】该酶具有较好的底物宽泛性,可识别丙酸、丁酸、2-甲基丙酸、戊酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸以及环己甲酸等一系列单酸。反应最适温度为30°C,最适p H为7.0。70°C保温8 h后仍有45%的活性残留,表明该酶相对比较稳定。通过活性中心3个位点的定点突变可以改变酶的底物特异性。【结论】C.owensensis OL来源的酯酰辅酶A合成酶是潜在的生物催化剂,可以用于聚酮前体的合成。     

以生物合成为基础的红霉素A的产量提高和结构改造

红霉素A是一种广谱大环内酯类抗生素,在临床上应用广泛。其生物合成包括由聚酮合酶催化的十四元环骨架形成,以及羟基化、糖基化、甲基化后修饰。基于对红霉素A生物合成机制的认识,可以对产生菌种进行定向的遗传操作,达到产量提高和结构改造等目的。本文综述了近年来在红霉素A高产菌株改造和化学结构衍生方面所取得的研究进展,为相关研究人员提供参考。     

乙酰辅酶A合成酶家族中保守的色氨酸残基的生化功能（英文）北大核心CSCD

甲烷菌与甲烷八叠球菌是仅有的两种已知利用乙酸盐进行甲烷生成的菌属。稻田以及厌氧的废物分解物是甲烷生物生成的主要来源。甲烷菌在自然界广泛分布,相比甲烷八叠球菌,在低乙酸盐的环境中对乙酸盐仍有高亲和力。在甲烷生成第一步即将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的过程中,与甲烷八叠球菌利用乙酸激酶与磷酸转乙酰酶激活途径不同,甲烷菌通过腺嘌呤形成乙酰辅酶A合成酶进行催化。在甲烷菌一属(Methanosaeta concilii)中,共发现5个乙酰辅酶A合成酶的编码基因,其中3种乙酰辅酶A合成酶的生化及酶活特性已被确定。该3种乙酰辅酶A合成酶均以乙酸盐为其最优底物。尽管在短链乙酰辅酶A合成酶家族中,发现酰基底物结合位点高度保守,但乙酰辅酶A合成酶家族的酰基底物范围极为广泛。本研究对甲烷菌中不同种乙酰辅酶A合成酶的酰基底物结合位点的关键氨基酸进行识别与比较,从而对乙酰辅酶A合成酶家族的酶活特性有更全面深入的了解。首先,我们对甲烷菌一属中乙酰辅酶A合成酶4进行生化性质测定。结果表明,该酶无催化一系列酰基底物为酰基辅酶A或其中间产物酰基腺苷酸的活性。通过序列对比发现,嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中高度保守的416位色氨酸残基在甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中被替换成528位苯丙氨酸残基。将甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中的528位苯丙氨酸残基点突变为色氨酸残基后,进行酶学性质测定,未检测到该突变体具有乙酰辅酶A/乙酰腺苷酸合成活性。我们进一步对嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中的416位色氨酸残基点突变为苯丙氨酸残基,酶活性质结果显示,突变酶对于乙酸盐以及丙酸盐作为底物时的活性未有明显差异。然而,以丙酸盐为底物时,释放丙酰腺苷酸中间产物。该结果表明,热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1对于底物乙酸盐或丙酸盐的催化作用不甚相同,苯丙氨酸中的苯甲酰环降低该酶保留中间产物丙酰腺苷酸,从而转化为丙酰辅酶A的能力。     

乙酰辅酶A合成酶家族中保守的色氨酸残基的生化功能（英文）

甲烷菌与甲烷八叠球菌是仅有的两种已知利用乙酸盐进行甲烷生成的菌属。稻田以及厌氧的废物分解物是甲烷生物生成的主要来源。甲烷菌在自然界广泛分布,相比甲烷八叠球菌,在低乙酸盐的环境中对乙酸盐仍有高亲和力。在甲烷生成第一步即将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的过程中,与甲烷八叠球菌利用乙酸激酶与磷酸转乙酰酶激活途径不同,甲烷菌通过腺嘌呤形成乙酰辅酶A合成酶进行催化。在甲烷菌一属(Methanosaeta concilii)中,共发现5个乙酰辅酶A合成酶的编码基因,其中3种乙酰辅酶A合成酶的生化及酶活特性已被确定。该3种乙酰辅酶A合成酶均以乙酸盐为其最优底物。尽管在短链乙酰辅酶A合成酶家族中,发现酰基底物结合位点高度保守,但乙酰辅酶A合成酶家族的酰基底物范围极为广泛。本研究对甲烷菌中不同种乙酰辅酶A合成酶的酰基底物结合位点的关键氨基酸进行识别与比较,从而对乙酰辅酶A合成酶家族的酶活特性有更全面深入的了解。首先,我们对甲烷菌一属中乙酰辅酶A合成酶4进行生化性质测定。结果表明,该酶无催化一系列酰基底物为酰基辅酶A或其中间产物酰基腺苷酸的活性。通过序列对比发现,嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中高度保守的416位色氨酸残基在甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中被替换成528位苯丙氨酸残基。将甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中的528位苯丙氨酸残基点突变为色氨酸残基后,进行酶学性质测定,未检测到该突变体具有乙酰辅酶A/乙酰腺苷酸合成活性。我们进一步对嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中的416位色氨酸残基点突变为苯丙氨酸残基,酶活性质结果显示,突变酶对于乙酸盐以及丙酸盐作为底物时的活性未有明显差异。然而,以丙酸盐为底物时,释放丙酰腺苷酸中间产物。该结果表明,热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1对于底物乙酸盐或丙酸盐的催化作用不甚相同,苯丙氨酸中的苯甲酰环降低该酶保留中间产物丙酰腺苷酸,从而转化为丙酰辅酶A的能力。     

琥珀酸脱氢酶或琥珀酰辅酶A合成酶缺失促进大肠杆菌积累5-氨基乙酰丙酸

5-氨基乙酰丙酸 (ALA) 是生物体内四吡咯类化合物的合成前体,在农业及医药领域应用广泛,是极具开发价值的高附加值生物基化学品。目前利用外源C4途径的重组大肠杆菌发酵生产ALA的研究主要利用LB培养基并添加葡萄糖和琥珀酸、甘氨酸等合成前体,成本较高。琥珀酸在C4途径中以琥珀酰辅酶A的形式直接参与ALA的合成。文中在以葡萄糖为主要碳源的无机盐培养基中研究了琥珀酰辅酶A下游代谢途径琥珀酸脱氢酶编码基因sdhAB和琥珀酰辅酶A合成酶编码基因sucCD缺失对ALA积累的影响。与仅表达异源ALA合成酶的对照菌株相比,sdhAB和sucCD缺失菌株ALA的产量分别提高了25.59%和12.40%,且ALA的积累不依赖于琥珀酸的添加和LB培养基的使用,从而大幅降低了生产成本,显示出良好的工业应用前景。     

RS基因的植物表达载体和酵母表达载体构建

白藜芦醇合酶(RS)是Res生物合成的关键酶之一,它催化1分子4-香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A反应合成Res.以花生中克隆的RS基因为基础,成功构建了RS基因的以Ubi为启动子的单子叶植物表达栽体pBIL-RS,为以后的基因工程遗传转化果蔗和其他单子叶植物改良其品质提供条件.同时构建了酵母表达载体pVT102U-RS,为下一步研究真核表达蛋白的生物活性提供条件,并为利用酵母生产Res提供了可能.     

地中海拟无枝酸菌“硝酸盐效应”的研究进展

地中海拟无枝酸菌"硝酸盐效应"是指发酵基质中的硝酸盐在一定浓度下大幅度促进该菌合成利福霉素,并对初级代谢产生多种影响的现象。针对该效应,本实验室开展了多年的研究,阐明硝酸盐主要通过两个方面促进利福霉素的生物合成:一方面,硝酸盐增加利福霉素生物合成前体的供给(如UDP-葡萄糖、AHBA、丙二酰Co A以及甲基丙二酰Co A等),尤其是通过抑制体内脂肪酸的合成来保障利福霉素前体丙二酰Co A的供给;另一方面,硝酸盐提升利福霉素生物合成酶基因的表达。因此,在充足的利福霉素前体和合成酶系的协同效应下,菌体生成大量的利福霉素。进一步的工作将围绕"硝酸盐效应"的信号分子、信号转导途径以及相关基因的表达调控和翻译后修饰机制等方面展开。     

垩唑霉素生物合成的反式酰基转移酶具有底物宽泛性

垩唑霉素生物合成中的聚酮合酶(PKS)均缺少酰基转移酶(AT)功能域,在聚酮合酶外含有两个独立的反式AT OzmM和OzmC。对反式AT的敲除及回补实验证明两个反式AT是垩唑霉素合成所必需的。AT的功能是将延伸单元丙二酰辅酶A或者甲基丙二酰辅酶A传递到酰基载体蛋白(ACP)。为了研究OzmM和OzmC在垩唑霉素生物合成中的功能,本研究以OzmM蛋白和PKS蛋白OzmK为研究对象,研究了反式AT是否和PKS蛋白存在相互作用及反式AT将延伸单元传递给ACP后是否仍和PKS蛋白存在相互作用。为确定OzmM的功能,本研究在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了OzmM蛋白并对其纯化进行体外实验,并且利用亲和共纯化和生物膜干涉技术验证了OzmM和OzmK之间的相互作用。本研究推测当OzmM将底物传递给ACP后会离开PKS蛋白,不参与延伸单元与聚酮主链的缩合反应,并且反式AT (OzmM)与PKS (OzmK)之间的弱相互作用是反式AT在ACP与PKS之间快速传递延伸单元的功能所必须的。另一个反式AT OzmC的功能为传递甲氧丙二酰ACP到OzmJ-ACP,本研究利用丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A对其底物宽泛性进行研究,发现OzmC可以将丙二酰辅酶A传递给OzmQ-ACP,但不可以传递甲基丙二酰辅酶A。     

小鼠正常黑色素细胞与黑色素瘤细胞(B16)mRNA表达差异分析

黑色素瘤是一种高侵袭性的恶性皮肤肿瘤,转移率高、预后差。研究黑素瘤细胞生物学特性对黑素瘤的治疗和控制具有重要的意义。本研究以C57BL/6J小鼠的正常黑色素细胞及B16黑色素瘤细胞为研究对象,采用二代测序技术分析两种细胞间的转录组表达差异,筛选差异基因,为后续黑色素瘤的形成机制研究提供理论依据。采用差异倍数及错误率分析测序数据,鉴定出1 436个新的mRNA和4 086个差异表达的已知mRNA。GO数据库和KEGG数据库分析显示,差异表达的mRNAs参与了149个调控途径,主要集中在疾病调控、细胞周期调节和环境信息调控方面。qRT-PCR及Western印迹检测发现,调节细胞增殖、迁移的Pdgf-B、Integrinβ1和Integrinβ5以及调节黑色素颗粒增加的Mitf、Tyr、Tyrp1和Tyrp2在B16细胞中的表达量显著高于在正常黑色素细胞中的表达。本研究获得的差异基因为后续黑色素瘤的研究提供了新的候选基因。     

骨形态发生蛋白9基因敲除小鼠的构建

目的运用CRISR/Cas9技术敲除小鼠基因组中Bmp9基因片段,构建Bmp9基因敲除小鼠。方法根据Bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA并合成。sgRNA体外转录后和Cas9mRNA混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小鼠。提取子代小鼠基因组DNA测序鉴定其基因型。基因型鉴定正确的小鼠与野生型交配后筛选纯合子小鼠。同时取纯合子小鼠心脏、肝、脾、肺、肾,匀浆后提取总RNA和总蛋白,通过qPCR、WB和免疫组化检测BMP9在各组织中的表达。结果设计并合成20bp的sgRNA并进行体外转录,显微注射并回植后得到基因突变小鼠,连续交配后得F2代纯合子。测序结果显示,突变小鼠存在两种基因型,一种为5bp缺失突变,另一种为13bp缺失并伴有1bp插入突变。与野生型C57BL/6相比,qPCR、WB和免疫组化结果均表明基因敲除小鼠肝中BMP9表达显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建出了BMP9基因敲除小鼠。     

AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌肠毒素E方法的建立

目的:利用AlphaLISA技术,建立新型均相检测方法,对金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)进行检测。方法:采用2种SEE抗体建立AlphaLISA检测方法,羊抗肠毒多克隆抗体同受体微球偶联,SEE小鼠单克隆抗体标记生物素,并同偶联了亲和素的供体微球连接,3种组分与待测抗原形成双抗体夹心结构,680nm的光激发供体微球产生能量,将周围反应体系中的氧分子转变为激发态,并将能量传递给受体微球,产生520~620nm的荧光,荧光信号与抗原浓度正相关。对该方法的反应体系进行优化,验证其重复性、敏感性和特异性,并采用该方法检测菌液上清和食品模拟样本。结果:所建立的AlphaLISA检测方法重复性较好,批间变异系数和批内变异系数皆小于10%;检测SEE的灵敏度可以达到100pg/mL,并与其他几种毒素均无交叉反应,具有较好的特异性。该方法也能够准确地对金黄色葡萄球菌菌液上清中的SEE进行检测,对食品模拟样本的检测也有较好的灵敏度。结论:建立了检测SEE的AlphaLISA方法。该方法均相免洗,操作便捷,用时短,灵敏度更高,可对菌液上清和不同食品模拟样本中的SEE进行检测。     

一株小麦赤霉病拮抗菌的筛选鉴定及防治效果分析

自小麦赤霉病发病田块土壤中,分离得到1株小麦赤霉病高效拮抗菌株。通过形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列比对分析,将这株拮抗菌株鉴定为奇异变形杆菌(proteus mirabilis)。P. mirabilis DY05发酵液和无细胞上清均可显著抑制禾谷镰刀菌菌丝体生长(抑制率分别为79.50%和51.25%)和分生孢子萌发(抑制率均为100%),减少呕吐毒素产生(分别减少84.32%和82.82%)。田间赤霉病防治试验结果显示,接种DY05,可降低发病率52.13%,同时病情指数降低48.74%,显示出较好的防治效果。促生生理活性评价试验结果显示,菌株DY05可以产生铁载体和IAA,并具有溶磷作用和ACC脱氨酶活性,具有很好的促生长潜力。盆栽试验结果表明,菌株DY05对小麦植株生长具有显著的促进作用。与对照组相比,菌株DY05处理可以显著增加小麦幼苗茎高、根长、鲜重和干重,其中茎高、根长、鲜重和干重分别提高了22.21%、26.41%、44.77%和26.53%。分离得到的拮抗菌株DY05具有拮抗病原真菌和促进植物生长的双重功能,为开发禾谷镰刀菌生物防治制剂提供了菌种材料。     

二苯乙烯苷抑制NADPH氧化酶对小鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用

目的探讨二苯乙烯苷(TSG)抑制NADPH氧化酶对小鼠脑缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用。方法将100只实验小鼠随机分成5组:假手术组、模型组,TSG低剂量组(3 mg/kg),TSG中剂量组(6 mg/kg),TSG高剂量组(12 mg/kg),每组20只。通过双侧颈总动脉结扎造成小鼠脑缺血2 h,再灌注24 h后处死小鼠。采用HE染色法对小鼠脑组织进行病理学检测,采用DHE染色法和ESR波谱仪检测脑组织中活性氧(ROS)水平,采用Western blot法检测脑组织中NOX4和cleaved caspase-3/9蛋白的表达。结果小鼠脑缺血再灌注后,缺血区皮层脑组织出现严重的病理性损伤,其ROS水平显著升高,脑组织中NOX4蛋白表达显著上调,凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/9蛋白表达量显著增加。TSG可以显著减轻小鼠缺血再灌注脑组织的病理性损伤,抑制ROS的产生,显著下调氧化应激蛋白NOX4的表达,并显著抑制凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/9蛋白的表达。结论 TSG可通过抑制脑组织氧化应激蛋白NOX4的表达,减少活性氧的生成,并抑制凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/9过度表达,对小鼠脑缺血再灌注损伤起保护作用。     

420～750 nm超连续谱光源和532 nm激光致兔视网膜损伤修复

超连续谱(SC)光源是一种宽光谱、高亮度、眼睛危害大的新光源,有关它致视网膜损伤研究却未见报道。为了观察SC光源致视网膜损伤特点和修复过程,试验将波长420～750 nm的SC光源与532 nm激光进行比较,采用两者平行光入射,在0. 1 s照射时间,3 mm角膜光斑直径条件下,用略高于视网膜损伤阈值的功率照射青紫蓝灰兔视网膜;通过检眼镜和HE染色观察视网膜照后4 h,1、3、7、14 d损伤修复过程。SC光源和532 nm激光致视网膜的损伤在检眼镜下为灰色小圆斑。照后4 h出现视网膜外核层固缩深染,感光细胞外节与视网膜色素上皮层(RPE)粘连;随后RPE层色素增生、损伤的外核层细胞丢失,损伤进行性加重; 3 d后色素细胞开始向外核层和内核层迁移,胶质细胞填充损伤区域。由此可见,波长420～750 nm的SC光源主要损伤视网膜外核层和RPE层,后期色素颗粒和胶质细胞填充损伤区域。其视网膜损伤特点和修复过程与532 nm激光类似。     

动物活体内细胞光操控的研究进展

动物活体环境下单细胞的光操控对于研究细胞的结构和功能,细胞与组织之间的相互作用,以及细胞病变机理、血栓形成机制和肿瘤细胞迁移等生物医学问题具有重要意义。2013年,光镊技术首次应用于活体动物内单细胞的捕获和操控,开辟了活体动物内光学操控新领域。本文就该领域涉及的活体操控技术及近来取得的重要研究进展进行概述,简要分析了实现深度组织内细胞操控所遇到的技术瓶颈并讨论了解决方案。     

生长标度——腕足动物异速生长研究中的定量指标

"生长标度"定义了在研究腕足动物异速生长时所需的个体生长发育定量指标,其数值大小受到壳长、壳宽、壳厚以及相对应权重的共同控制。将腕足动物待研究性状的测量值与其生长标度作为两个变量进行二元回归分析,可判断该性状是否存在与腕足动物个体发育不等的生长速率,即异速生长。该指标对凯迪期(Katian)(晚奥陶世)腕足动物无洞贝类Rongatrypa xichuanensis的定量分析表明,该种腕足动物的壳宽与个体发育保持同步,壳长呈负异速生长,壳厚呈正异速生长,指示出该种生物在生长过程中总体向横宽方向伸展,并伴随着壳体的加快增厚。