脂肪酶lipAB操纵子在防御假单胞菌中的克隆、表达及活性研究

对荚壳伯克氏菌PG1(Burkholderia glumae PG1)基因组中的脂肪酶操纵子lipAB片段进行直接克隆,构建含有脂肪酶基因的分泌表达载体,实现其在防御假单胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)中的异源表达,并研究重组工程菌的胞外脂肪酶活性。利用Red/ET直接克隆技术获得克隆载体p15A-cm-lipAB;再通过亚克隆技术构建重组表达载体pBBR1-km-lipAB和pBBR1-km-Papra-lipAB,将这两个表达载体分别电转至Pf-5中,通过卡那霉素或者阿伯拉霉素抗性筛选得到转化子,以三丁酸甘油酯平板扩散法和对硝基苯酚法检测脂肪酶酶活,并通过实时荧光定量PCR检测启动子的替换对lipA表达的影响。本研究从PG1中成功克隆了脂肪酶操纵子lipAB(GenBank accession number:AJK49931. 1 and AJK49932. 1);成功构建了重组工程菌Pf-5/pBBR1-km-lipAB和Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB,并成功检测到两株工程菌的胞外脂肪酶活性;以LB培养基培养至24 h时,启动子优化后lipA基因表达量是原始水平的2. 1倍;在LB培养基摇瓶发酵至66 h时,Pf-5/pBBR1-km-lipAB的脂肪酶酶活最高且为13. 51 U/mL,而Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB的酶活为46. 85 U/mL,是Pf-5/pBBR1-km-lipAB的3. 47倍。初步实现基因lipA在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Papra比lipAB的原始启动子PlipAB效率更高,为将来实现规模化生产奠定了技术基础。     

产鼠李糖脂生物表面活性剂大肠杆菌的构建与优化

目前鼠李糖脂生物表面活性剂主要由条件致病的铜绿假单胞菌生产获得,从而影响工业应用。为了开发一种相对安全的鼠李糖脂生产菌,将带有不同强度组成型合成启动子的鼠李糖基转移酶基因(Rhamnosyltransferase gene,rhl AB)以单、中、高3种拷贝数分别在大肠杆菌ATCC 8739中异源表达,实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。对rhl AB基因和rha BDAC基因簇(TDP-L-鼠李糖合成的基因簇)进一步利用合成启动子进行组合调控,筛选获得了最优生产鼠李糖脂工程菌——大肠杆菌TIB-RAB226。对大肠杆菌TIB-RAB226进行发酵温度优化,鼠李糖脂产量达到124.3 mg/L,是优化前的1.17倍。通过分批补料发酵,12h时鼠李糖脂产量达到209.2 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的5类质核比不同的鼠李糖脂同系物。本研究可为异源合成产鼠李糖脂提供重要参考。     

9株海洋来源铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂的比较分析

目的:从海洋来源的铜绿假单胞菌中筛选多株具有鼠李糖脂合成能力的菌株。方法:以9株分离自不同海洋环境的铜绿假单胞菌为研究对象,考察并比较其发酵合成鼠李糖脂生物表面活性剂的表面活性、产量和产物成分的差异,扩增并比对合成途径中的关键基因。结果:9株菌的发酵产物均具有表面活性,其中菌株1A01151发酵液的表面活性最强,表面张力值可降低至28 m N/m;9株菌的基因组中均含有鼠李糖脂合成途径中关键基因rhl AB和rhl C,都具有合成单、双鼠李糖脂的能力;菌株1A01151和1A00364的发酵产量最高(2.69 g/L),产物经LC-MS/MS检测,所合成的鼠李糖脂同系物组分不同,双糖双脂的含量最高(1A01151:75.96%;1A00364:61.01%)。结论:海洋来源的铜绿假单胞菌是具有鼠李糖脂高产潜力的菌株,可用于合成性能不同、组成多样的鼠李糖脂生物表面活性剂。     

Construction of recombinant strain containing vitreoscilla hemoglobin gene(Vnb) of aeruginosa and its rhamnolipid expressing conditions

将RDR(ribonucleotide diphosphate reductase)启动子驱动下的透明颤菌(Vitreoscilla sp.)血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)基因的表达载体pSETRDR-VHb转入铜绿假单胞(Pseudomonas aeruginosa)S301菌株中.并对其中阳性转化子AY26菌株进行了鼠李糖脂表达条件的研究.正交实验L9(43)优化培养基,最佳组分为:硫酸镁0.075％、硝酸钠0.5％、清油3mL/L、酒石酸钠0.4％.在限碳培养条件下,转化子SY26鼠李糖脂产量达到12.9 g/L,比对照菌株S301(8.4 g/L)提高150％,5L发酵罐放大实验验证,重组菌AY26的表面活性剂产量达到33.12 g/L.     

预水解发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3产鼠李糖脂特性及应用效能的影响研究

发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3(Pseudomonas aeruginosa NY3)产鼠李糖脂(Rhamnolipids,Rha)的特性影响较大。研究了利用废弃动物油作为发酵碳源时,其碱预水解和酶预水解对NY3菌发酵产鼠李糖脂产量、产物结构和性能的影响,从碳源水解酸值与水解产物、鼠李糖脂组分结构和实际应用效果进行了研究。碱、酶预水解实验发现,碳源酸值由初始的19.81 mg/g分别提高到72.04 mg/g和73.75 mg/g,气质联用(GC-MS)分析检测结果表明,碱、酶预水解后,碳源均释放7种C14-C18碳链的脂肪酸,鼠李糖脂产量由未预水解的8.28 g/L分别提高到15.35 g/L和17.63 g/L。液质联用(LCMS-IT-TOF)分析结果表明,用未预水解及碱、酶预水解碳源发酵时,NY3菌所产鼠李糖脂中单糖脂含量分别为62.07%、65.67%、87.32%。利用NY3菌在中试条件下处理高浓度石化企业油污泥,发现鼠李糖脂能促进NY3菌去除油污泥中的石油烃,且促进作用强弱顺序为未预水解产Rha碱预水解产Rha酶预水解产Rha。     

发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3所产鼠李糖脂结构及性能的影响

为研究发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3所产鼠李糖脂结构及性能的影响,从鼠李糖脂的结构组分、性能和应用效果等方面展开研究。薄层实验证明两种鼠李糖脂均含有单糖脂和双糖脂。液质分析发现以橄榄油作碳源时,鼠李糖脂中双糖脂(Rha-Rha-C5-C6:1和Rha-Rha-C8-C8:2)比例更大,约为73.09%。而地沟油作碳源时,单糖脂(Rha-C10-C10和Rha-C16-C16:2)的比例更高,约为76.91%。橄榄油和地沟油为碳源的鼠李糖脂的临界胶束浓度(CMC)分别为55 mg/L和80mg/L。相同投加量时,前者乳化性和乳化稳定性均优于后者。NY3菌降解含油污泥时,投加双糖脂含量高的鼠李糖脂会使C16-C30直链烷烃的去除率更高。     

含血红蛋白基因(VHb)的铜绿假单胞菌重组菌的构建及鼠李糖脂表达条件的研究

将RDR（ribonucleotide diphosphate reductase）启动子驱动下的透明颤菌（Vitreoscillasp．）血红蛋白（Vitreoscilla hernoglobin,VHb）基因的表达载体pSETRDR-VHb转入铜绿假单胞（Pseudamanas aeruginosa）s301菌株中。并对其中阳性转化子AY26菌株进行了鼠李糖脂表达条件的研究。正交实验k（4。）优化培养基,最佳组分为：硫酸镁0．075％、硝酸钠0．5％、清油3mUL、酒石酸钠0．4％。在限碳培养条件下,转化子SY26鼠李糖脂产量达到12．9dL,比对照菌株S301（8．4g／L）提高150％,5L发酵罐放大实验验证,重组菌AY26的表面活性剂产量达到33．12g／L。     

以甘油为底物鼠李糖脂高产菌株的诱变选育

通过诱变选育,将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)RG-14利用甘油发酵生产鼠李糖脂产量由13.6g/L提高到16.5 g/L。突变株经过5次连续传代培养,菌株仍维持稳定的鼠李糖脂产量,表明该菌株具有较好的遗传稳定性。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术分析诱变后菌株发酵甘油生产鼠李糖脂的组成,结果显示鼠李糖脂由Rha-C8-C8、Rha-C8-C10、Rha-C10-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12组成,其中单、双鼠李糖脂的相对丰度分别为54.8%和45.2%。当以工业粗甘油代替精甘油为底物时,该菌株鼠李糖脂产量达到14.2 g/L,表明其具有较好的应用潜力。     

铜绿假单胞菌中鼠李糖脂生物合成的研究进展*

鼠李糖脂因其具有环境友好和卓越的物理化学特性,而有望成为化学合成表面活性剂的替代物。近年来鼠李糖脂得到了广泛的研究,其目的是利用低价的可再生资源进行大规模生产,但目前的研究成果仍不足以选育出更具商业竞争力的鼠李糖脂过量合成菌株。为此,进一步理解鼠李糖脂生物合成的复杂基因调控网络,探索降低生产成本的发酵工艺势在必行。综述了铜绿假单胞菌中鼠李糖脂的生物合成途径、群体感应对主要基因的调控、鼠李糖脂在生物膜形成中所发挥的作用,以及发酵优化对鼠李糖脂产量的影响。有助于加深对鼠李糖脂生物合成的认识,为提高鼠李糖脂产量提供重要参考信息。     

铜绿假单胞菌中鼠李糖脂生物合成的研究进展*

鼠李糖脂因其具有环境友好和卓越的物理化学特性,而有望成为化学合成表面活性剂的替代物。近年来鼠李糖脂得到了广泛的研究,其目的是利用低价的可再生资源进行大规模生产,但目前的研究成果仍不足以选育出更具商业竞争力的鼠李糖脂过量合成菌株。为此,进一步理解鼠李糖脂生物合成的复杂基因调控网络,探索降低生产成本的发酵工艺势在必行。综述了铜绿假单胞菌中鼠李糖脂的生物合成途径、群体感应对主要基因的调控、鼠李糖脂在生物膜形成中所发挥的作用,以及发酵优化对鼠李糖脂产量的影响。有助于加深对鼠李糖脂生物合成的认识,为提高鼠李糖脂产量提供重要参考信息。     

响应曲面法优化铜绿假单胞菌DN1的产鼠李糖脂条件

鼠李糖脂是近年来具有广阔应用前景的生物表面活性剂之一,因应用范围广和环境友好等特点,使其成为潜在的合成表面活性剂的替代品。本研究以一株能产生鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DN1为研究对象,采用Plackett-Burman设计和响应曲面方法(RSM)对其产鼠李糖脂的发酵条件进行优化。Plackett-Burman试验设计表明,磷酸盐、C/N比和p H值对鼠李糖脂的产量具有显著影响。在此基础上,采用RSM对3个显著因素的最佳水平范围进行研究,结果表明当磷酸盐为1.71 g/L、C/N比为15.5、p H值为6.5时,其理论最佳鼠李糖脂产量为40.4 g/L,与实测鼠李糖脂产量39.84 g/L非常接近。摇瓶优化后的鼠李糖脂产量较优化前的22.9 g/L提高了73.97%。     

合成乙醇重组乳杆菌的研究

将含有Zymomonas mobilis乙醇合成途径的关键酶基因的片段Ptac-pdc和Ptac-adhB,分别/同时接入pHY300PLK以及pBBR1MCS-5载体中,得到了pHY-PA、pBBR-PA等重组质粒,分别转化入几株乳杆菌。在42℃下进行乙醇发酵试验,结果表明:在Lactobacillus plantanum CICIM B0080中同时引入基因pdc、adhB有效地将碳代谢流导向了产乙醇方向,重组菌B0080(pHY-PA)发酵6.7%葡萄糖60h分别产生0.4%(V/V)乙醇,为原始菌B0080的67倍;而将pdc、adhB基因同时引入L.amylovorus B0112和L.acidophilus B0068,能检测到相当于原始菌2倍的乙醇产出。在重组菌发酵过程中,仍有大量的乳酸产出,在引入产乙醇基因的同时敲除乳酸脱氢酶基因,将有可能使乳杆菌的代谢流向更有效地转向产乙醇途径。     

荧光假单胞菌M18rpoD克隆及其对抗生素合成的影响

荧光假单胞菌M18对多种植物病原真菌具有显著的抑制作用。荧光假单胞菌(Pseuclomones fluorescens)M18能同时合成吩嗪1羧酸（PCA）和藤黄绿菌素(Plt) 两种抗生素。从M18的基因组中克隆了rpoD基因,其相应的氨基酸序列与荧光假单胞菌CHAO中RpoD蛋白的氨基酸序列完全相同。利用基因重组技术和大肠杆菌荧光假单胞菌穿梭质粒pME6032,将rpoD置于强启动子Ptac的控制下,导入M18菌株。发现经重组质粒转化的M18,与对照相比,培养基中PCA和Plt开始累积的时间分别提前4h和8h,积累量提高1倍和6倍。     

枯草芽孢杆菌L-脯氨酸合成途径中glnA、proB、proA基因功能探究

【目的】从基因水平探究枯草芽孢杆菌渗透压调节因子L-脯氨酸合成途径中glnA、proB、proA基因的功能,通过分子改造实现对代谢途径的人工扰动。【方法】从枯草芽孢杆菌WB600出发,通过向胞内引入一系列基因敲除或过表达,分别构建了proB和proA基因过表达的重组菌WB601和WB602、glnA基因缺失的重组菌WB603以及在此基础之上过表达proB基因的重组菌WB604。借助菌株胞外和胞内游离脯氨酸积累的表型分析影响途径的关键节点。【结果】在非胁迫条件下,重组菌WB601和WB602胞外脯氨酸含量分别是原始菌的2.21倍和2.82倍,单位细胞胞外脯氨酸得率分别是原始菌的4.09倍和9.80倍,胞内游离脯氨酸含量分别是原始菌的1.91倍和3.34倍;重组菌WB603胞外脯氨酸含量上升至1221.43 mg/L,是原始菌的6.28倍,单位细胞胞外和胞内游离脯氨酸得率分别为原始菌的9.13倍和3.66倍;而重组菌WB604胞外脯氨酸含量最高达1391.65 mg/L,相比菌株WB603,其胞外脯氨酸含量及单位细胞得率分别提高了13.94%和14.10%,且胞内游离脯氨酸含量提高了32.60%。在5%Na Cl胁迫条件下,重组菌WB601和WB602的胞外脯氨酸含量分别是原始菌的1.94倍和1.54倍,单位细胞胞外脯氨酸得率分别是原始菌的2.15倍和2.19倍;重组菌WB603胞外脯氨酸含量及其单位细胞得率分别是原始菌的4.16倍和7.29倍;相同条件下,相比于重组菌WB603,重组菌WB604的胞外脯氨酸含量及其单位细胞得率分别提高了32.61%和5.54%。此外,实验组菌株的胞内游离脯氨酸含量均高于非胁迫时,并达到相对平衡状态。【结论】proB和proA基因的过表达均能显著提升细胞合成脯氨酸的能力,并且能增强细胞的耐盐性;glnA基因的缺失能增强脯氨酸合成途径,提高脯氨酸的积累;两种效应的正向叠加可进一步提升细胞脯氨酸合成能力。     

启动子Ptac与PsbA在鱼腥藻7120中表达hG-CSF的效率比较

为了比较外源性启动子Ptac与内源性启动子PsbA在鱼腥藻7120中表达外源基因时的效率,构建了分别含Ptac和PsbA两种启动子的穿梭表达载体pRL-PsbA-GCSF、pRL-Tac-GCSF;利用三亲结合转移法转化鱼腥藻7120,利用抗生素筛选,通过质粒提取和PCR方法鉴定,获得了分别由2种启动子驱动表达hG-CSF的转基因蓝藻,转基因藻中目的基因以质粒形式存在;利用半定量RT-PCR方法对2种转基因藻的hG-CSF转录水平进行比较,发现PsbA启动子驱动效率与Ptac启动子没有明显差异;利用ELISA方法比较hG-CSF蛋白表达量,发现PsbA启动的蓝藻中hG-CSF表达量是Ptac诱导条件下表达量的1.17倍。     

液化沙雷氏菌磷脂酶A1的克隆表达及乳糖自诱导发酵

为了利用大肠杆菌高效生产重组磷脂酶,克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的编码基因pla,分别使用pET-28a(+)和pET-20b(+)载体,实现了磷脂酶A1在大肠杆菌BL21(DE3)中的功能表达.重组菌利用载体pET-28a(+)在原始信号肽的介导下胞外PLA1酶活达40.8 U/mL,占总酶活的91％.重组菌转接至优化后的发酵诱导培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖0.8 g/L,乳糖5 g/L,25 mmol/L Na2HPO4,25 mmol/L KH2PO4和1 mmol/L MgSO4;菌体生长6h后,添加7.5 g/L的甘氨酸,37℃恒温发酵24 h,重组菌胞外PLA1酶活达到128.7 U/mL.     

铜绿假单胞杆菌O-2-2产鼠李糖脂的发酵培养基优化及LC-MS/MS分析

鼠李糖脂是一种性能优良的生物表面活性剂,在生物医药、环境保护、二次采油等方面具有很高的应用潜力.采用响应面分析法,对铜绿假单胞杆菌O-2-2的培养基进行了优化.Plackett-Burman(PB)实验设计表明,磷酸盐、硝酸盐和微量元素对鼠李糖脂的产量具有显著影响.Box-Behnke (BB)优化确定最佳培养基组成为磷酸盐、硝酸盐和微量元素用量分别为3.2g/L、13.76g/L和5.17ml,理论的最大产量为8.48g/L,与实测糖脂产量8.85g/L接近.摇瓶优化后的鼠李糖脂产量较优化前的6.24g/L提高了30.8％.最优化条件下采用10％的接种量逐级放大,并通过补料发酵,最终200L罐的鼠李糖脂产量达到70g/L,发酵时间仅为110h.采用新发明的二次蒸馏工艺,鼠李糖脂纯度达86.6％.液质联用(LC-MS)分析表明所生产的鼠李糖脂成分及含量为:双糖单脂32.9％、双糖双脂17.02％、单糖单脂3.16％、单糖双脂33.54％.     

Pseudomonas protegens H78中抗真菌剂藤黄绿菌素的合成及其基因簇分析

假单胞菌株H78是本实验室从油菜根际分离得到的一株生防细菌。通过16S r RNA及藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)合成基因plt C基因(编码聚酮合成酶)保守区段进行PCR测序,初步确定H78菌株可能属于P.protegens。本研究旨在进一步克隆H78菌株的Plt生物合成基因簇,分析其Plt合成特性以及H78菌株的分类地位。对假单胞菌株H78进行全基因组de novo测序;使用blast工具,分析假单胞菌株H78与P.protegens Pf-5、CHA0、P.aeruginosa M18、LESB58中Plt合成基因簇的同源性;使用KMB培养基对菌体进行发酵,测定菌体生长,对Plt合成进行HPLC测定。假单胞菌H78的Plt合成基因簇与其它4个菌株都存在保守的基因组成与布局,在Plt合成基因编码氨基酸序列上,H78与CHA0、Pf-5菌株的一致性高达99%~100%,其中与CHA0同源性更高;而与铜绿假单胞菌M18及LESB58菌株的一致性相对较低,为52%~88%。在KMB培养基中,假单胞菌株H78中累积合成Plt超过30滋g/m L。H78菌株属于P.protegens,其Plt合成基因簇与P.protegens Pf-5、CHA0具有高度同源性,而铜绿假单胞菌M18、LESB58的Plt基因簇存在不同的进化起源;H78菌株能合成较高水平的Plt,通过进一步研究改造,此菌有潜力成为安全并高效合成Plt的生防菌株。     

大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜群体密度感应系统调控毒力因子表达的影响

目的通过体外测定铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）群体密度感应（Quorum Sensing,QS）系统调控的毒力因子表达,比较大蒜素干预前后毒性因子表达的差异以及对铜绿假单胞菌PAO1成熟生物膜（biofilm,BF）的影响。方法应用ELISA法比较处理前后外毒素A的含量差异;利用弹性蛋白一刚果红染色的方法,测定处理前后弹性蛋白酶活性;用蒽酮一硫酸法测定鼠李糖脂;利用荧光酶标仪检测青脓素含量变化;利用激光共聚焦显微镜观察干预前后大蒜素对铜绿假单胞菌成熟BF的影响。结果大蒜素干预后与生理盐水对照组比较,外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和青脓素表达分别由（19．630±0．573）pg/μl、（0．467±0．003）、（2．009±0．063）g／L、（9325．833±367．675）下降到（6．529±0．289）pg／μl、（0．032±0．001）、（0．269±0．009）g／L、（7819．167±111．800）。激光共聚焦显微镜观察可见生理盐水对照组细菌菌落云集呈蘑菇状分布,干预组黏附的细菌稀疏散在平坦分布。结论大蒜素可抑制铜绿假单胞菌群体密度感应系统调控的毒力因子表达,减弱其毒力,干扰BF分化成熟。     

操纵子前导区的修饰及PRPP合成途径的加强对大肠杆菌积累L-组氨酸的影响

目的:基于转酮酶基因缺失菌株MG1655-ΔtktA,研究启动子替换L-组氨酸操纵子前导区及6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd、PRPP合成酶基因prs的过表达对大肠杆菌产L-组氨酸的影响。方法:通过Red重组系统用T5启动子替换L-组氨酸操纵子前导区;构建gnd和zwf串联表达载体gnd-zwf-pSTV28,prs表达载体prs-pQE30。通过摇瓶发酵,考察上述改造对大肠杆菌积累L-组氨酸的影响。结果:测定结果显示,改造菌株的发酵液中均能实现L-组氨酸积累,平均分别为MG1655-ΔtktA-PT5,60.12 mg/L;MG1655-ΔtktA-PT5(prs-pQE30),66.47mg/L;MG1655-ΔtktA-PT5(zwf-gnd-pSTV28),89.69 mg/L;MG1655-ΔtktA-PT5(prs-pQE30,zwf-gnd-pSTV28),111.56 mg/L。结论:L-组氨酸操纵子前导区的修饰使菌株合成L-组氨酸的能力大大增强,而氧化戊糖磷酸途径的加强和PRPP合成酶活性的提高能够进一步提高产量。