三种组成型启动子调控的鼠李糖脂基因在防御假单胞菌中的异源表达及活性研究

本研究利用Red/ETDNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因RhlAB的分泌表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰,将3种不同强度组成型启动子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替换了RhlAB基因在铜绿假单胞菌中的原始启动子,成功获得了表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB,pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB,并将这些表达载体分别在防御假单胞菌Pf-5中异源表达,通过LB培养基发酵42h后,Pf-5/pBBR1-genta-RhlAB的鼠李糖脂产量为17.56mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB分别是11.135mg/L,441.135mg/L,557.764mg/L,启动子优化后产量分别是原始启动子的0.63,25.12和31.76倍。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物。并通过实时荧光定量PCR检测RhlAB基因的表达量,发现启动子替换为Ptac和PrhaB后RhlAB基因表达量分别是原始启动子的2.16和2.77倍。本研究初步实现了RhlAB基因在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Ptac和PrhaB比RhlAB的原始启动子表达效率更高,可为异源合成鼠李糖脂提供重要参考。     

基于T7表达系统的洋葱伯克霍尔德菌G63脂肪酶同源高效表达

为实现对洋葱伯克霍尔脂肪酶的可控高效表达, 将目前被广泛使用的T7重组蛋白高效表达系统移植到洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)G63中进行脂肪酶同源表达。首先采用PCR从大肠杆菌BL21(DE3)中得到T7 RNA 聚合酶基因(T7 RNAP)并将其克隆到致死质粒pJQ200SK上, 然后在T7 RNAP 前后各加入500 bp用于同源重组的片段, 再通过三亲本杂交把T7 RNAP整合到B. cepacia基因组上, 使T7 RNAP受到脂肪酶基因(lipA)启动子调控。接着把lipA和它的伴侣基因lipB单独或全部克隆到载体pUCPCM和pBBR22b上, 构建出pBBR22blipAB、pBBR22blipA、pUCPCMlipAB、pUCPCMlipA、pUCPCMΔlipAlipB、pUCPCMΔlipA、pUCPCMΔlipB七种表达质粒, 通过电转化将上述表达质粒转化到含T7 RNAP的B. cepacia宿主菌中, 最终得到一系列脂肪酶基因工程菌。通过摇瓶诱导发酵发现含表达质粒pUCPCMlipAB的工程菌脂肪酶酶活最高, 达到607 U/mg, 与野生菌相比酶活力提高2.8倍, 并且除含pUCPCMΔlipB的工程菌外, 其它工程菌的脂肪酶酶活均有不同程度提高。野生菌与工程菌pUCPCMlipAB的发酵液经硫酸铵沉淀, Sephadex G-75凝胶过滤纯化后, 比酶活分别为29 984 U/mg和30 875 U/mg。以上结果表明, 构建的基于T7表达系统的B. cepacia脂肪酶基因工程能有效提高脂肪酶的表达量, 同时说明分泌信号PelB和增强转录的核糖体接合位点对脂肪酶的表达有促进作用。     

产脂肪酶重组枯草芽胞杆菌的发酵优化

笔者所在实验室前期筛选到1株产脂肪酶粘质沙雷氏菌,克隆其脂肪酶基因,构建重组枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis 168/pMA5-lipA,成功实现了来源于粘质沙雷氏菌的脂肪酶基因在枯草芽胞杆菌中的表达。基于以上工作基础上,对B.subtilis 168/pMA5-lipA进行了摇瓶水平上的产酶发酵优化。首先通过单因素和正交试验确定了有利于产脂肪酶的最佳培养基成分,并对发酵条件进行了优化。结果表明:优化后的培养基组分为蔗糖35 g/L,玉米浆27.5 g/L,(NH4)2SO41.25 g/L,CaCl24 g/L,pH 7.0。在最优发酵培养基的条件下,37℃、160 r/min摇床培养33 h,每毫升发酵液中重组菌脂肪酶酶活可达98.6 U,是优化前的3倍。     

粘质沙雷氏菌脂肪酶基因的克隆表达和酶学性质的研究

目的:克隆粘质沙雷氏菌脂肪酶基因(lipA)使其在大肠杆菌B121(DE3)中实现高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究.方法:以产脂肪酶粘质沙雷氏菌总DNA为模板,PCR扩增脂肪酶基因lipA,构建重组表达载体pET-lipA,并将其导入大肠杆菌进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质的测定.结果:经过优化培养条件,脂肪酶活力最高能达到104U/mL.重组脂肪酶的最适反应温度为40～45℃,最适pH为7.0～7.5,在50℃保温1h下仍能保持80%的酶活力,Ca2+、Sr2+、Mn2+和Mg2+对脂肪酶酶活有较强的激活作用,尤其是Ca2+使脂肪酶酶活提高了1倍多,而Ni2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+和Al3+对酶活具有较强的抑制作用,尤其是Zn2+和Al3+使酶活力几乎完全丧失.该酶对一些有机溶剂有较好的耐受性,与50%甲醇混合24h,仍能保持84%的酶活力.结论:该脂肪酶具有较好的热稳定性和甲醇耐受力,作为生产生物柴油的催化剂具有很大的应用价值,为基因工程酶法生产生物柴油打下良好的基础.     

产碱假单胞菌脂肪酶的克隆表达及酶学性质研究

【目的】克隆产碱假单胞菌的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌中异源表达并进行酶学性质研究。【方法】通过基因文库构建和PCR,获得脂肪酶基因,并以pET30a(+)为表达载体、E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在大肠杆菌中进行异源表达,表达产物经HisTrapTM亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从产碱假单胞菌中克隆得到一个脂肪酶基因,大小为1 575 bp(GenBank登录号为JN674069)。该酶分子量为55 kD,最适底物为p-NPO,最适反应温度和pH分别为35°C、pH 9.0。重组酶经1 mmol/L的Cu2+处理30 min可使酶活提高至156%。在最适反应条件下重组酶的比活力为275 U/mg,Km和Vmax分别为80μmol/L和290 mmol/(min.g protein)。【结论】产碱假单胞菌脂肪酶基因的克隆与表达不仅积累了脂肪酶基因的资源,并为其在手性拆分中的应用奠定基础。     

过表达TatAdCd转位酶对枯草芽孢杆菌脂肪酶分泌的影响

【目的】研究过表达枯草芽孢杆菌Tat运输途径的Tat Ad Cd转位酶对促进脂肪酶分泌的影响。【方法】用cdd基因的串联启动子和前导区,替换tat AD-CD操纵子的启动子和前导区,并在染色体sac B基因位点整合表达;采用q RT-PCR方法表征tat AD-CD操纵子的表达水平;用脂肪酶表达质粒p HP13L转化Tat Ad Cd转位酶过表达菌株,构建产脂肪酶重组菌。通过测定脂肪酶活性,以及聚丙烯酰胺凝胶电泳,考察Tat Ad Cd转位酶过表达对脂肪酶分泌的影响。【结果】tat AD-CD操纵子被过表达,其胞内m RNA相对水平提高了185倍。Tat Ad Cd转位酶的过表达,使脂肪酶发酵单位提高了40%。【结论】使用cdd基因的串联启动子和前导区,能够有效地过表达目的基因;枯草芽孢杆菌脂肪酶可以同时经由Sec途径和Tat途径分泌;过表达Tat Ad Cd转位酶,能够显著提高脂肪酶的分泌量。     

产朊假丝酵母整合表达载体的构建

[目的]构建一个产朊假丝酵母(Candida utilis,C.utilis)整合表达载体.[方法]该载体以质粒pBR322为骨架,包括3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子和终止子、放线菌酮(CYH)抗性基因和18S rDNA介导的同源整合区.再以木聚糖酶基因为目标基因,插入pGLR9K载体上,构建重组表达载体,电击转化C.utilis.对阳性转化子进行酶活测定,检测其表达情况.[结果]转化子的胞内外都可检测到木聚糖酶酶活,酶活可达60 U/mL.[结论]本实验构建了一个C.utilis载体,并用此载体表达了木聚糖酶基因,本研究将为产朊假丝酵母工程菌在饲料添加剂及食品行业中的应用提供又一个新的实验平台.     

重组枯草芽孢杆菌诱导表达AiiA及酶活性鉴定

[目的]由于Aii A(Autoinducer inactivation,Aii A)蛋白能有效降解AHLs(N-acyl-homoserine,AHLs),导致病原菌由于群体淬灭(Quornm quenching,QQ)失去生存优势而抑制其致病能力;利用强启动子构建能高效表达Aii A蛋白的枯草芽孢杆菌,检验枯草芽孢杆菌中Pspac启动子表达Aii A蛋白的能力,寻求有效生物防治手段防治病原菌侵害。[方法]通过已知的aiiA基因序列和启动子Pspac序列设计引物,经搭桥PCR搭连启动子Pspac和aiiA基因,构建重组表达载体Pspac-aiiA-PHY300PLK,经酶活反应确定重组菌活性。[结果]成功克隆并搭连Pspac启动子和aiiA基因,Aii A蛋白成功在重组枯草芽孢杆菌C11中表达。经酶活检验,野生菌株和重组菌株Pspac-aiiA-C11有降解信号分子AHLs的能力,但重组菌降解能力更强。[结论]重组菌Pspac-aiiA-C11较野生菌株有更强的降解AHLs效力;要利用工程菌进行生物防治还需进一步提高工程菌表达Aii A蛋白的能力及稳定性。     

一种酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2/CT/α-factor的构建及鉴定

以pPIC9为模板,通过PCR扩增获得酿酒酵母的α-交配因子（α-factor）,并克隆至酿酒酵母胞内表达载体pYES2/CT中,构建了一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2/CT/α-factor（pYCα）。再将甘露聚糖酶基因（mannase,man）通过酶切、连接克隆至pYCα的α-factor的下游,构建了pYCα-man重组载体检验pYCα的分泌性能和稳定性。结果显示α-factor可引导甘露聚糖酶基因在胞外分泌表达,在曲利本兰培养基上形成明显的水解圈,进一步分析重组菌胞外和胞内酶活,结果显示对照INVSc1/pYCα的两种酶活都未检测到,而INVSc1/pYCα-man具有明显的胞外酶活,未检测到胞内酶活,说明构建的pYCα具有良好的分泌性能;稳定性实验表明重组质粒连续培养150 h仍具有良好的稳定性。     

液化沙雷氏菌磷脂酶A1的克隆表达及乳糖自诱导发酵

为了利用大肠杆菌高效生产重组磷脂酶,克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的编码基因pla,分别使用pET-28a(+)和pET-20b(+)载体,实现了磷脂酶A1在大肠杆菌BL21(DE3)中的功能表达.重组菌利用载体pET-28a(+)在原始信号肽的介导下胞外PLA1酶活达40.8 U/mL,占总酶活的91％.重组菌转接至优化后的发酵诱导培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖0.8 g/L,乳糖5 g/L,25 mmol/L Na2HPO4,25 mmol/L KH2PO4和1 mmol/L MgSO4;菌体生长6h后,添加7.5 g/L的甘氨酸,37℃恒温发酵24 h,重组菌胞外PLA1酶活达到128.7 U/mL.     

Secretory expression of arginine deiminase in E.coli

将变形假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因arcA克隆至具有阿拉伯糖启动子的分泌型表达载体pBAD/gⅢ B中,经鉴定得到重组质粒pBAD-ADI.将重组质粒转化大肠杆菌TOP10F’后进行诱导表达,分别考察了不同诱导物L-arabinose浓度、诱导温度、诱导时间对重组蛋白表达的影响,最适诱导条件为L-arabinose浓度0.002％ (w/v),25℃下诱导5h,全细胞的酶活为68 mU/mL(指单位发酵液体积,下同).采用Osmotic Shock法使ADI从胞周质释放出来,经检测分泌到胞周质的重组蛋白活性为53 mU/mL,细胞内的酶活为34 mU/mL.SDS-PAGE分析显示,重组蛋白大小约为46 kD.     

表达NM23-H1/NDPK-A工程菌的遗传稳定性研究

目的:研究重组工程菌的遗传稳定性。方法:利用重组表达质粒pBVNM-H1转化宿主菌E.coli DH5α,筛选重组工程菌DH5α-pBVNM-H1。将新构建好的重组工程菌在无选择压力的条件下进行连续传代培养,比较菌落在LB(-)和LB(+)培养基上的生长状况,并对传代菌株目标蛋白的表达情况以及质粒数量和目的基因DNA进行电泳鉴定。结果:重组工程菌连续传代50次中,在LB(-)和LB(+)培养基上的生长状况相同,目标蛋白表达量无显著差异,质粒数量及目的基因DNA结构稳定。结论:重组工程菌DH5α-pBVNM-H1具有良好的遗传稳定性。     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

短小芽孢杆菌HZbp脂肪酶基因的克隆表达

以短小芽孢杆菌HZbp总DNA为模板以PCR的方式获得512 bp的脂肪酶基因,并在该基因的两端引入了EcoR1和Sal1的酶切位点,将该基因与大肠杆菌表达质粒pSE380连接,获得重组质粒pSE380-BPL。重组质粒转入大肠杆菌表达细胞株BL21,获得工程菌株BL21-BPL。序列分析显示所克隆的基因具有脂肪酶的保守G-X-S-X-G序列,SDS-PAGE电泳显示该脂脂肪酶的分子质量约为20 kDa。在LB培养基中,IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L,33℃诱导培养10 h后,发酵液酶活达到8 U/mL。     

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达

【目的】克隆洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达。【方法】首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性。在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G+C含量,获得优化的脂肪酶基因。再分别把原始和优化的脂肪酶基因导入载体pGAPZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO。分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌。经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。【结果】4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW37.8U/mL,pPIClipO129.5U/mL,pGAPlipW40.2U/mL和pGAPlipO184.3U/mL。改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍。酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性。【结论】通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达。大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求。     

扩展青霉脂肪酶基因克隆、密码子优化及表达

【目的】克隆扩展青霉脂肪酶基因,实现具强催化活性的脂肪酶的异源高效表达。【方法】利用RT-PCR扩增扩展青霉CICC 40356脂肪酶(PEL)cDNA序列,利用重叠延伸PCR(Over-lap extension PCR)技术对PEL的10个稀有氨基酸密码子和表达载体pPIC9Kα信号肽的9个氨基酸密码子进行了优化,获得了改造过的脂肪酶基因PELM和表达载体pPIC9KM。并构建了带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL1、pPIC9KM-PELM1、pPIC3.5K-PEL1、pPIC3.5K-PELM1和不带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL2、pPIC9KM-PELM2六个重组质粒。利用对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测工程菌脂肪酶的酶活。在此基础上,对工程菌的酶学性质进行了研究。【结果】扩展青霉脂肪酶基因cDNA序列分析结果表明该序列与已报道PEL cDNA序列仅相差3个碱基,同源性高达99%。6个重组工程菌在甲醇诱导下,均表现出pNPP水解活性,28℃诱导100h时酶活达到最高,发酵上清的酶活分别为3.65 U/mL、30.49 U/mL、90.85 U/mL、212.05 U/mL、15.29 U/mL、76.32 U/mL。SDS-PAGE结果表明重组脂肪酶分子量均约28 kDa。酶学性质研究表明,重组脂肪酶PELM最适温度为35℃,最适pH为9.5,在pH7.0-10.0范围内该脂肪酶均较稳定,Ca2+和Mg2+对其有激活作用,Fe2+、Zn2+、Cu2+则有抑制作用,EDTA能使之快速失活。以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其对中链酯(C8-C12)有较强的水解能力,最适底物为为C8的pNP酯。【结论】密码子优化后的扩展青霉脂肪酶基因在毕赤酵母中获得理想的表达,其酶活力比未优化的野生脂肪酶的提高了2.3-2.5倍,表明定点突变对其基因本身更改特有稀有密码子是实现PEL功能蛋白的异源高效表达的有效策略之一。     

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶异源表达研究

目的：以地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶基因（amyL）为报告基因,构建含不同启动子的枯草杆菌表达载体,转化枯草杆菌,并对重组菌的酶活进行分析,比较不同启动子对amyL基因在枯草杆菌中表达的影响。方法：以高温α-淀粉酶高产菌株B.licheniformis0204染色体DNA为模板,PCR扩增得到amyL并分别与PQ启动子和P43启动子进行连接构建表达载体pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL,化学法转化枯草杆菌1A717,筛选得到重组转化子后对重组菌的表达产物进行SDS-PAGE和酶活检测。结果：重组菌摇瓶发酵105h后测定高温α-淀粉酶酶活,B.subtilis1A717（pUB-PQ-amyL）的最高酶活为280.1U/mL,B.subtilis1A717（pUB-P43-amyL）的最高酶活为190.5U/mL。结论：PQ启动子调控的高温α-淀粉酶最高表达水平是P43启动子调控的最高表达水平的1.47倍,说明PQ启动子能使amyL基因在枯草杆菌中更高效地表达。     

普通变形杆菌位置非特异性脂肪酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

【目的】本文拟克隆普通变形杆菌(Proteus vulgaris)脂肪酶基因,并实现其在大肠杆菌中的高效表达,并检验外源表达脂肪酶的催化性质。【方法】通过PCR方法,从P.vulgaris基因组中扩增其脂肪酶基因(PVL),并将其开放读码框区域连接到表达载体pET-DsbA及pMBP-P上,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达。我们对培养基组分及培养条件进行优化,以获得最高的酶产量。用Ni柱亲和层析法对所得重组脂肪酶进行纯化,并考察其酶学性质。【结果】PVL基因编码区含864个碱基,编码含287个氨基酸的酶蛋白。该序列在GenBank的登录号为FJ643627。PVL基因在大肠杆菌BL21内诱导表达的最佳条件为:在pH8.5的LB培养基中添加15g/L葡萄糖及200mg/L氨苄青霉素,在培养至OD600为1.2时加入100mg/LIPTG,15℃诱导15h,最高酶活达到192.2U/mL。通过亲和层析纯化了重组脂肪酶,得到一个约31kDa的蛋白条带。外源表达的脂肪酶的催化特性与野生菌脂肪酶相似,具有催化的位置非特异性,对长链脂肪酸酯亲和性最高。【结论】PVL基因在大肠杆菌中的高效表达为P.vulgaris脂肪酶的进一步研究与应用奠定基础。     

树干毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据NCBI中的木糖还原酶基因序列设计引物,利用高保真聚合酶克隆树干毕赤酵母木糖还原酶基因,加A后克隆到质粒pGM-T中,测序验证.然后将目的基因克隆到舍有强启动子的穿梭表达载体p424GPD中,构建含有XYL1基因的重组质粒p424GPD-XYL1.将p424GPD-XYL1转化到大肠杆菌中,提取总蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.酶活测定确定木糖还原酶基因XYL1在大肠杆菌中得到活性表达,表明表达载体构建成功.表达载体的成功构建为后续构建重组酿酒酵母利用木糖发酵奠定基础.     

累积番茄红素的大肠杆菌工程菌及其培养条件的研究

噬夏孢欧文氏菌番茄红素合成相关基因crtE, crtB, crtI同时克隆进表达载体pET-15b构建pET-15bcrtIEB,将该重组质粒转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌,IPTG诱导工程菌累积红色色素,经HPLC和吸收光谱分析,工程菌中合成的色素为番茄红素。研究了碳源、金属离子、培养温度、诱导剂浓度、诱导时间等参数对工程菌生长及色素累积的影响,确定了合适的培养条件：培养基为改良LB培养基（蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、麦芽糖5g/L、MgCl2 0.1g/L,NaCl 10g/L）;起始培养温度为37℃;培养至OD600为0.6左右时加入IPTG,终浓度为0.5mmol/L,诱导温度降至30℃;诱导时间为14h。发酵完成后工程菌的生物量（干重）为3.45g/L,番茄红素的最高含量可达5.8mg/gDW。