| 脂肪酶lipAB操纵子在防御假单胞菌中的克隆、表达及活性研究 |
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| 引用本文： | 方倩,谢芝玲,陈汉娜,李建伟,潘登,丁学知,夏立秋,涂强,张友明.脂肪酶lipAB操纵子在防御假单胞菌中的克隆、表达及活性研究[J].激光生物学报,2018(5):442-450. |
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| 作者姓名： | 方倩 谢芝玲 陈汉娜 李建伟 潘登 丁学知 夏立秋 涂强 张友明 |
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| 作者单位： | 1.淡水鱼类发育生物学国家重点实验室湖南师范大学生命科学学院微生物分子生物学湖南省重点实验室410081;2.山东省土壤肥料总站250100;3.山东大学生命科学学院山东大学亥姆霍兹生物技术研究所微生物技术国家重点实验室266237;4.山东大学苏州研究院215123; |
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| 基金项目： | 湖南省发展生物工程和新产品合作创新中心(20134486)；中国博士后科学基金(2018M632669)；山东省自然科学基金(ZR2017ZB0212)；高等学校学科创新引智计划B16030；苏州科技发展计划(SYG201507) |
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| 摘 要： | 对荚壳伯克氏菌PG1(Burkholderia glumae PG1)基因组中的脂肪酶操纵子lipAB片段进行直接克隆,构建含有脂肪酶基因的分泌表达载体,实现其在防御假单胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)中的异源表达,并研究重组工程菌的胞外脂肪酶活性。利用Red/ET直接克隆技术获得克隆载体p15A-cm-lipAB;再通过亚克隆技术构建重组表达载体pBBR1-km-lipAB和pBBR1-km-Papra-lipAB,将这两个表达载体分别电转至Pf-5中,通过卡那霉素或者阿伯拉霉素抗性筛选得到转化子,以三丁酸甘油酯平板扩散法和对硝基苯酚法检测脂肪酶酶活,并通过实时荧光定量PCR检测启动子的替换对lipA表达的影响。本研究从PG1中成功克隆了脂肪酶操纵子lipAB(GenBank accession number:AJK49931. 1 and AJK49932. 1);成功构建了重组工程菌Pf-5/pBBR1-km-lipAB和Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB,并成功检测到两株工程菌的胞外脂肪酶活性;以LB培养基培养至24 h时,启动子优化后lipA基因表达量是原始水平的2. 1倍;在LB培养基摇瓶发酵至66 h时,Pf-5/pBBR1-km-lipAB的脂肪酶酶活最高且为13. 51 U/mL,而Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB的酶活为46. 85 U/mL,是Pf-5/pBBR1-km-lipAB的3. 47倍。初步实现基因lipA在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Papra比lipAB的原始启动子PlipAB效率更高,为将来实现规模化生产奠定了技术基础。
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| 关 键 词： | B.glumaePG1 lipAB Red/ET同源重组 P.protegensPf-5 异源表达 |
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