五种主要上呼吸道病毒多重RT-PCR 检测方法的建立

目的:建立甲型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、B型(RSV-A、RSV-B)和腺病毒(ADV)五种主要上呼吸道病毒的多重RT-PCR检测方法。方法:利用Primer premier5.0分别针对甲型流感病毒的M基因、乙型流感病毒的PB1基因、RSV-A和RSV-B的F基因及ADV的hexon基因设计五对特异性引物,对Mg2+、dNTP、引物浓度及退火温度等进行优化,建立同时检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV的多重RT-PCR方法,并验证该检测方法的灵敏性。结果:所建立的五种病毒的多重RT-PCR方法可以同时或者分别扩增甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B及ADV的141bp、635bp、525bp、377b和283bp基因片段,敏感度分别达到770PFU/ml、800PFU/ml、680PFU/ml、970PFU/ml和850PFU/ml,且五种病毒间无交叉反应。结论:所建立的多重RT-PCR方法可以迅速准确地检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV,为五种病毒的检测提供了一种方便易行的方法。     

GeXP多重PCR技术同时检测12种常见呼吸道病毒

本研究建立了一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重RT-PCR检测方法,该方法可以同时检测12种呼吸道病毒,包括流感病毒A型和B型、季节性H1N1、副流感病毒1～3型、人鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、人博卡病毒。针对病原体保守区序列设计12种病毒的特异性引物,分别用已验证的阳性标本为模板检验多重体系的特异性。多重检测体系在10~3拷贝/μL水平可同时检测到12种病毒。另检测24份临床标本,以real-time RT-PCR为参考标准,进一步验证检测体系。结果表明,这种基于GeXP系统的新方法灵敏度高、特异性强,可以快速同时检测12种常见呼吸道病毒。     

5种呼吸道病毒Array-ELISA检测方法的建立

目的:建立能够同时检测常见呼吸道病毒的Array-ELISA方法。方法:未经标记的单克隆抗体作为捕获抗体在96孔板的微孔中点制成阵列,生物素标记的单克隆抗体作为检测抗体,与待检病毒反应后,利用电化学发光法放大反应信号,通过CCD传感器读取反应结果。结果:经过优化后,使用的抗体组合能够检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒3型,其最低检测限分别为3.1×102、1.3×103、5×103、2.5×103和1.5×104TCID50/m L,各病毒之间未见交叉反应。结论:建立的Array-ELISA方法可用于检测以上5种病毒,具有较高的灵敏性和较强的特异性。     

副流感病毒的研究进展

副流感病毒是一类有包膜的单股负链RNA病毒,属副黏病毒,是一种常见的易被忽略的呼吸道感染病原体,主要引起婴幼儿及儿童严重的下呼吸道感染,其致病性仅次于呼吸道合胞病毒(RSV).目前,对副流感病毒的感染,缺乏有效的治疗药物和病毒疫苗.因此,建立快速、敏感和特异的副流感病毒感染的诊断方法,研发新型抗病毒药物和安全有效的副流感病毒疫苗成为研究热点.本研究就副流感病毒的生物学特性、疫苗研究、防治及检测技术作一综述.     

569例呼吸道感染住院儿童7种常见呼吸道病毒病原学分析

目的了解呼吸道感染住院患儿呼吸道病毒的分布情况。方法选取2015年7月至2016年6月呼吸道感染的住院患儿病例,抽取鼻咽分泌物,采用直接免疫荧光法检测常见的7种病毒,即呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IVA)、乙型流感病毒(IVB)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒2型(PIV2)、副流感病毒3型(PIV3)、腺病毒(IVD)。结果共有569例样本送检,193例病毒检测阳性(33.92%),其中有3例为2种病毒的混合感染。男性共369例,女性共200例。其中RSV、PIV3、ADV的感染率居前三位。呼吸道病毒的感染率随着患儿年龄的增长逐渐下降,除新生儿外,6个月内的婴幼儿呼吸道病毒检出率最高。RSV检测阳性率自11月开始呈增高趋势,12月最高,达55.86%。PIV3的检出高峰出现在7月,达13.64%。结论 RSV是本地区儿童呼吸道感染最常见的病毒。呼吸道病毒的检出率与年龄、季节等因素有关。     

利用表面增强拉曼光谱技术分析温度及pH值对H1N1亚型流感病毒增殖的影响

表面增强拉曼光谱(SERS)是一种基于纳米颗粒的拉曼光谱,可以高灵敏度地检测流感病毒等重要病原微生物,鉴定不同毒株间的差异。为了建立一种快速检测流感病毒SERS的方法,本实验利用SERS技术对流感病毒H1N1亚型不同毒株在不同温度和pH值的条件下进行了病毒毒价强弱的检测,将流感病毒样品与金纳米颗粒混合静置后用拉曼共聚焦显微镜进行激光扫描。结果显示在pH为7.2、温度为37℃的条件下3个H1N1亚型的毒株SERS检测结果显示均出现至少1个大于(或等于)3 000的峰值,该状态下病毒毒价最强,最适合病毒生长。另外,细胞生物学方法与SERS技术结果一致,检测中均表现出较好的稳定性和准确性。     

禽流感病毒H9N2在人肺组织的复制

禽流感病毒H9N2亚型在多种陆禽流行并反复感染哺乳动物猪和人,其对公共卫生安全呈潜在巨大威胁。本文应用体外禽流感病毒H9N2亚型感染人肺组织和免疫组化实验,探讨禽流感病毒H9N2亚型跨种间感染人的机制、H9N2病毒在人肺组织复制特性及组织嗜性。结果显示,禽流感病毒H9N2亚型(Ck/GX/1875/04、Ck/GX/187/05)和季节性人流感病毒H3N2亚型(A/ST/602/05)均可感染人肺组织;免疫组化检测流感病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP),病毒复制的主要靶细胞为肺泡细胞、呼吸细支气管上皮细胞和细支气管上皮细胞;免疫组化和免疫荧光双重染色法检测流感病毒感染肺泡类型,禽流感病毒H9N2亚型感染II型肺泡细胞。结果提示,禽流感病毒H9N2可适应宿主人以及在人肺上皮细胞有效复制,病毒持续感染人有助于病毒基因进化进而演变成大流行新型流感病毒的潜能。     

不同亚型甲型流感病毒在单个核细胞内复制情况研究

目的研究不同亚型的甲型流感病毒在单个核细胞内的复制情况,探讨其免疫应答机制。方法①细胞培养:复苏A549、MDCK细胞后,用DMEM培养液常规培养;外周血分离得到单个核细胞,用RPMI1640常规培养;②空斑形成试验:用空斑试验检测病毒A/Shantou/169/2006(H1N1)和A/Shantou/602/2006(H3N2)的病毒原始滴度;检测流感病毒感染单个核细胞后的病毒滴度变化。结果流感病毒感染单核细胞后,上清液的病毒滴度下降,36、48、72 h病毒滴度<10 PFU/mL;而其细胞裂解液病毒滴度上升,滴度由9.5×10~4 PFU/mL上升至1.63×10~5 PFU/mL。流感病毒感染淋巴细胞,其细胞上清和裂解液病毒滴度均下降,其中上清液H3N2病毒滴度在48、72 h均<10 PFU/mL;裂解液病毒滴度则由4.8×10~5 PFU/mL下降至1.8×10~3 PFU/mL。结论不同亚型的甲型流感病毒在单核细胞和淋巴细胞中的复制存在差异。单核细胞可以吞噬流感病毒但不能直接灭活流感病毒,而淋巴细胞却可以直接抑制流感病毒的复制。     

重组人干扰素α2a滴鼻剂抗病毒药效学研究

为了检测干扰素滴鼻剂抗病毒药效作用,采用组织细胞培养法及建立流行性感冒动物模型,对不同浓度的干扰素滴鼻剂进行了体内外抗病毒药效学研究。结果显示:在体外有抑制流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腺病毒、柯萨奇B3病毒的作用,对单纯疱疹病毒有部分抑制作用。在体内可有效抑制流感病毒所致的病毒性肺炎。可见,重组人干扰素α2a滴鼻剂在体内外均有较明显的抗呼吸道病毒的作用。     

同时检测新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒的单管多重荧光定量PCR方法

本研究设计的一种4重荧光定量RT-PCR检测方法,以A型流感病毒各亚型的血凝素基因(HA)为检测靶标,实现了同时检测新甲型H1N1流感病毒、人季节性H1N1流感病毒和人季节性H3N2流感病毒。本法使用人细胞RNA酶P基因作为内参,以判断标本来源和实施质量控制。利用不同来源和亚型的流感病毒验证了该方法的特异性;利用连续稀释的新甲型H1N1流感病毒HA全基因体外转录物进行灵敏度分析。结果表明该方法灵敏度高,可检测低至20个拷贝的RNA;特异性强,每对引物只检测出对应的病毒,无交叉反应;并且成功地验证性检验了34份新甲型H1N1流感病毒阳性临床标本和20份人季节性H1N1和H3N2流感病毒及人乙型(HB)流感病毒阳性临床标本。因此,该多重荧光定量RT-PCR法是一种可同时检测2009年新甲型流感病毒及季节性流感病毒的有效方法。     

RNAs of influenza A, B, and C viruses.

The nucleic acids of influenza A, B, and C viruses were compared. Susceptibility to nucleases demonstrates that influenza C virus, just as influenza A and B viruses, possesses single-stranded RNA as its genome. The base compositions of the RNAs of influenza A, B, and influenza C virus are almost identical and comparative analysis on polyacrylamide gels shows that the genome of influenza C/GL/1167/54 virus, like that of the RNAs of influenza A and B viruses, is segmented. Eight distinct RNA bands were found for influenza A/PR/8/34 virus and for influenza B/Lee/40 virus. The RNA of influenza C/GL/1167/54 virus separated into at least four segments. The total molecular weights of the RNA of influenza A/PR/8/34 and B/Lee/40 virus were calculated to be 5.29 X 10(6) and 6.43 X 10(6), respectively. A minimum value of 4.67 X 10(6) daltons was obtained for influenza C/GL/1167/54 virus RNA. The data suggest that influenza C viruses are true members of the influenza virus group.     

禽流感与猪流感病毒：跨越物种传播的新认识

今年在墨西哥暴发的流感疫情来源于一种新的流感病毒：甲型H1N1病毒．这种病毒包括人源,禽源和猪源等甲型流感病毒基因片段,为混合毒株．比较了禽、猪和人的流感病毒在其天然宿主中的致病机理,主要目的是评估猪和禽的流感病毒成为人兽共患病的可能性,同时还评估猪在禽流感病毒传入人的过程中可能起到的作用．禽流感和猪流感作为人畜共患疾病,在流感病毒从动物到人的传播过程中起到关键的作用．猪作为流感病毒的中间宿主,具有混合器作用,人、猪、禽流感病毒可在其体内进行基因重排产生新病毒,并可能跨越种间屏障感染人类．但是流感病毒本身的跨越种间障碍传播不足以引起人流感的大暴发,动物流感病毒必须经过显著的遗传变异后才能使其在人群中长期存在．     

流感病毒基因的密码子偏好性及聚类分析

流行性感冒病毒是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒,它造成急性上呼吸道感染,并由空气迅速传播,在世界各地常有周期性的大流行。根据该病毒的基因组CDS序列,探讨了基因组序列密码子的使用模式和特性,并进行了病毒间的聚类分析。结果表明:流感病毒的G+C含量均低于A+U含量,偏向使用以A、U结尾的密码子的程度比使用以G、C结尾的较高,CUG、UCA、AGU、AGC、AGA、AGG、GUG、CCA、ACA、GGA、GCA、AUU、UGA、CAU、CAA、AAU、AAA、GAA等18个密码子为流感病毒共有的偏好性密码子,且以A结尾的居多,尤其偏爱AGA、GGA。聚类结果表明首先亚洲流感病毒H2N2和香港流感病毒H2N2聚为一类,亚洲流感病毒H1N1和俄罗斯流感病毒H1N1聚为一类,1997年和2003年~2004年发生的人禽流感聚为一类,说明它们的密码子使用的偏好性相似;而2009年爆发的甲型H1N1流感和任何一个流感的距离都比较远,说明甲型H1N1流感病毒是一种新型的病毒,不同于以往任何一种流感病毒。     

Properties of the erythrocyte receptors for influenza C virus.

Properties of the receptor for influenza C virus were studied. Although the receptor for influenza C virus on chicken erythrocytes was destroyed by the homologous virion, neuraminidase activity could not be detected in any of the influenza C virus strains tested. The receptor activity of chicken erythrocytes for influenza C virus was diminished by formaldehyde treatment but not by periodate oxidation. There was a considerable variation in the pattern and the titer of hemagglutination of influenza C virus when human erythrocytes of different blood types were used; the virus agglutinated most type B erythrocytes but not type A erythrocytes. By using human type B erythrocytes, differences among strains of influenza C virus in the hemagglutinating activity were also demonstrated. These results showed that both the receptor for and the receptor-destroying activity of influenza C virus were completely different from those of influenza A or B virus and also that carbohydrates were not involved in the receptor for influenza C virus.     

Enzymological characteristics of avian influenza A virus neuraminidase

Neuraminidases of 18 strains of avian influenza A virus were examined by both colorimetric and fluorometric assays using fetuin and 4-methylumbelliferyl-N-Ac-alpha-D-neuraminide as substrates, respectively, to compare them with those of human influenza A and B viruses. The ratios of the neuraminidase activity of avian influenza virus measured by the colorimetric assay method to that measured by the fluorometric assay were distributed in the range of 2.4-20.3. The enzyme of avian influenza virus showed calcium-ion dependence in both assay methods. These results suggest that neuraminidase of avian influenza A virus is varies greatly from one strain to another in substrate specificity as compared with those of human influenza A and B viruses, and that some strains of avian influenza A virus have a neuraminidase with unique enzymological characteristics different from that of human influenza A virus as well as that of influenza B virus.     

A/H1N1流感—世界关注的焦点

2009年4月,A/H1N1流感在墨西哥和美国暴发。随后,疫情迅速蔓延到美洲、欧洲、亚洲多个国家。A/H1N1流感病毒是一种以前在人或动物身上从未观测到的新病毒。遗传进化和抗原特性分析表明该病毒和猪流感病毒密切相关,与人类的季节性流感病毒有明显区别。但是流行病学信息表明A/H1N1流感病毒只攻击人类,并在人与人之间传播,尚未发现动物向人类传播的情况。本文从A/H1N1流感病毒的生物学特性、临床特征、公共卫生意义等方面全面阐述了A/H1N1流感的最新研究进展,为正确认识和科学防控A/H1N1流感提供参考。     

季节性流感病毒与其他病原混合或继发感染的研究进展与思考

流感病毒包括甲(A)、乙(B)、丙(C)和丁(D)四种型。人流行性感冒是由甲型和乙型季节性流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病。流感病毒感染患者主要表现出呼吸道症状,严重时可以导致肺炎。此外,与其他病毒、细菌和支原体等病原体混合或继发感染时,会增加流感患者的重症率和死亡率。近几年,流感病毒与其他病原协同感染的病例有增加趋势。本文归纳总结了流感病毒与其他病原混合及继发感染的研究现状,希望为流感病毒复杂感染情况的临床诊断和治疗方案的制定提供线索。     

异型流感病毒感染小鼠肺细胞因子水平变化

为了制备能够抵御不同型别流感病毒感染的疫苗,揭示机体对异型流感病毒感染交叉免疫保护作用的主要机制,用流感病毒疫苗免疫小鼠后分别感染同型、异型流感病毒,另设使用免疫增强剂IL-2后感染异型流感病毒组,观察小鼠的一般状况和肺指数,并用ELISA方法测定肺匀浆中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10的含量。结果显示,异型免疫组和异型免疫加强组病毒感染后细胞因子IFN-γ含量明显高于感染前（P〈0.05）。研究表明,异型病毒感染后IFN-γ水平明显增高,此细胞因子可能在流感病毒异型间交叉保护免疫反应中起重要作用,其机制有待进一步研究确定。     

Pattern recognition molecule mindin promotes intranasal clearance of influenza viruses

The innate immune response is essential for host defense against microbial pathogen infections and is mediated by pattern recognition molecules recognizing pathogen-associated molecular patterns. Our previous work has demonstrated that the extracellular matrix protein mindin functions as a pattern recognition molecule for bacterial pathogens. In this study, we examined the role of mindin in influenza virus infection. We found that intranasal infection of mindin-deficient mice by influenza virus resulted in dramatically increased virus titers in the lung and intranasal cavity of mutant mice. In contrast, lungs from intratracheally infected mindin-deficient mice contained similar influenza virus titers. We showed that mindin interacted with influenza virus particles directly and that mindin-deficient macrophages exhibited impaired activation after influenza virus infection in vitro. Furthermore, intranasal administration of recombinant mindin significantly enhanced the clearance of influenza virus in wild-type mice. Together, these results demonstrate that mindin plays an essential role in the host innate immune response to influenza virus infection and suggest that mindin may be used as an immune-enhancing agent in influenza infection.     

禽流感治疗药物研究进展

禽流感是由正黏液病毒科甲型流感病毒引起的对人类健康和社会发展构成极大威胁的烈性传染病,高致病性禽流感暴发突然,具有极高的发病率和死亡率。目前具有确切疗效的抗禽流感治疗药物品种很少,公认的药物只有奥塞米韦,此外流感病毒的抗药性也是一个重要的问题,近年来出现的甲型H1N1病毒更给人类敲响了警钟,因此研究更多的治疗药物和治疗手段对于禽流感的防控十分必要。从禽流感治疗化学药物和生物药物几个方面对禽流感治疗研究进展进行了综述。