一个人类凋亡相关新基因TFAR15的cDNA克隆化与表达

运用cDNA RDA(cDNA Representationaldifferencesanalysis)的方法 ,已获得了在细胞因子依赖性红白血病细胞系TF 1中撤除GM CSF(Granulocytemacrophage colonystimulatingfactor)后表达增高的多个基因片段 ,其中一个经GenBank检索为新基因 .利用RACE (rapidamplificationofcDNAends)和EST (expressedsequencetags)重叠片段拼接的方法克隆了该基因的cDNA全长序列 ,命名该基因为TFAR1 5 (TF 1cellapoptosisrelatedgene 1 5 ) .TFAR1 5全长cDNA由 1 2 1 8个碱基组成 ,其分布十分广泛 .随着GM CSF的去除 ,TF 1细胞中TFAR1 5的mRNA和蛋白表达水平均有不同程度的增高 .体外活性研究发现 ,重组TFAR1 5蛋白片段可抑制人胚肾细胞 2 93的自然凋亡 .     

二烯丙基二硫作用于K562细胞后凋亡相关基因的差异表达

目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide DADS)作用于人白血病K562细胞后凋亡相关基因的差异表达,为进一步探讨DADS诱导K562细胞凋亡的分子机制提供基础.方法:采用瑞士-吉姆萨和Hoechst33342染色观察细胞形态学变化.运用基因芯片技术检测40 mg/LDADS作用于K562细胞24h后凋亡相关基因的差异表达,选择其中上调基因GADD45A、下调基因HO-1运用RT-PCR技术进行验证.结果:40mg/L的DADS作用于K562细胞后出现凋亡所具有的典型形态学变化.40 mg/L DADS作用K562细胞24 h后有14个凋亡相关差异表达基因.GADD45A、HO-1基因表达情况与基因芯片结果一致.结论:DADS可能通过多个基因和多条信号转导通路共同作用诱导人白血病细胞K562凋亡.     

丙酮醛诱导细胞凋亡相关基因SHMT2L的生物信息学分析

基因芯片是一种高通量地同时研究多个基因表达的有力工具.在用基因芯片技术检测丙酮醛诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡的基因表达研究中.发现一个新基因SHMT2L,其表达为显著下调,并推测该基因与细胞凋亡密切相关.利用生物信息学方法对SHMT2L基因及其蛋白产物进行各种分析,结果发现SHMT2L基因与线粒体丝氨酸羟甲基转移酶具有较高的相似性.SHMT2L在细胞中低表达与丙酮醛造成DNA损伤所引发的细胞凋亡相关.     

TFAR19促进小鼠肝线粒体膜通透性转运孔的开放

TFAR19基因 (TF 1cellapoptosisrelatedgene 19)是北京大学人类疾病基因中心从人白血病细胞株TF 1细胞中克隆到的凋亡相关新基因之一 (GenBank登记号AF0 1495 5 )。初步研究发现 ,该基因在细胞凋亡时高表达 ,并且表达产物具有抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡作用。但是其确切的作用机制不明。线粒体膜完整性破坏所导致促凋亡因子 (如细胞色素c等因子 )的释放是细胞凋亡关键性的控制因素。线粒体膜通透性转运孔 (PTP) ,对线粒体膜完整性具有重要的调控作用。研究了重组人TFAR19蛋白在体外条件下 ,对线粒体PTP、跨膜电位 ,以及细胞色素c释放的影响。结果表明 ,TFAR19蛋白使分离的小鼠肝线粒体PTP开放、线粒体跨膜电位下降 ,以及细胞色素c释放。TFAR19对线粒体的上述作用是通过促进PTP开放起作用的。实验结果提示 ,TFAR19对线粒体凋亡信号有正反馈放大作用 ,并进一步揭示了TFAR19促进细胞凋亡的机制     

凋亡相关基因的整合分析及基因表达芯片的制备

利用IPI和GenBank,收集了与凋亡相关的5 333条基因序列,用一定的标准,整合筛选得到1 384个凋亡相关的基因．通过亚细胞定位、组织表达差异显著性分析、自然正义/反义RNA对预测、基因簇在pathway上的定位、蛋白质/蛋白质相互作用等方面的分析发现,一些基因只在一个组织里显著差异表达,一些基因存在自然正义/反义RNA对现象,一些基因簇同时位于多条pathway等重要信息．同时,制作了一张凋亡相关基因的寡核苷酸芯片,并且对于一对NAIF1表达质粒转染前后的HeLa样品,通过该芯片的筛选,得到24个差异表达的基因．发现NAIF1过表达诱导的细胞凋亡,伴随了PAX2、PDCD8、PDCD10、DFFA、CASP7等基因表达的显著变化,同时还发现,U58668,该mRNA没有任何基因或蛋白质的注释信息,当camptothecin诱导U937细胞系凋亡时上调,在这里的NAIF1过表达诱导的HeLa细胞系中也上调(上述数据结果见http://gpcrome.cbi.pku.edu.cn:2005/chip)．     

应用DNA芯片鉴定HPV18 E6-siRNA诱导HeLa 细胞凋亡的分子机制

高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）的E6基因在宫颈癌的发生中起关键作用,特异siRNA能有效抑制宫颈癌HeLa 细胞内HPV18 E6基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡.为进一步探讨HPV18 E6-siRNA诱导HeLa 细胞凋亡的分子机制,针对HPV18-E6基因设计siRNA序列,利用人源U6启动子为模板,经PCR表达框架法体外扩增,转染宫颈癌HeLa细胞抑制HPV18 -E6基因表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡.对转染前后HeLa细胞总RNA样品进行荧光标记后,与Agilent Human 1A寡核苷酸芯片杂交、扫描、数据分析及标准化处理,确定表达差异的基因并经荧光定量PCR对部分基因进行验证,结合PANTHER数据分析系统,将这些基因按照生物学功能进行归类,查阅GenBank数据库及相关文献,对其结果进行深入分析及讨论.在检测的18 716个基因和EST中,共筛出差异表达基因359个,其中307个基因表达上调,52个基因表达下调,主要包括细胞周期相关基因CCNG1、p21;凋亡相关基因CASP4、CASP6、IGFBP3、DFFA;泛素蛋白酶解途径相关基因E6-AP、UBE2C;角化细胞分化相关基因KRT4、KRT6E、KRT18;抑癌基因RECK、VHL等.研究结果表明,HPV18 -E6基因抑制引起的细胞凋亡效应主要是通过P53信号途径和泛素蛋白酶解信号途径调节细胞周期相关基因和凋亡相关基因的表达,从而抑制HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡.同时,抑癌基因的激活,角化细胞分化和免疫相关基因的表达上调,都说明了E6抑制后肿瘤细胞恶性转化程度的下降.     

氧化修饰LDL诱导U937细胞凋亡及其机制探讨

用氧化修饰低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导人髓系白血病细胞株U937细胞凋亡,并研究其作用机制.用脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术(TUNEL法)、流式细胞仪和DNA断裂分析检测细胞凋亡;用免疫组化检测c-fos、c-jun和c-myc蛋白表达,RT-PCR显示c-fos、c-jun和c-myc mRNA表达水平.结果表明ox-LDL可致U937细胞凋亡,其作用具有浓度效应;ox-LDL可以上调c-fos、c-jun和c-myc基因表达,使c-fos、c-jun和c-myc蛋白合成增多,最终诱导U937细胞凋亡.     

细胞凋亡和代谢基因在转移倾向结肠癌中的研究

目的:应用基因微阵列技术初步筛选与不同转移倾向结肠癌相关的细胞凋亡和代谢相关基因,研究转移相关基因功能.方法:取结肠癌肝转移和无转移结肠癌组织,采用人全基因组表达谱芯片获得两组织的基因表达谱,分析比较两者之间细胞凋亡和代谢基因的差异表达情况;利用基因数据库检索结肠癌相关基因,分析基因功能.结果:应用含有16450个克隆(其中3869个未知)的cDNA微阵列分析发现,细胞凋亡或肿瘤相关基因中,2倍以上(Ratio值小于0.5或大于2.0)差异基因共216个,上调基因85个,下调基因129个.表达差异5倍以上(Ratio值小于0.2或大于5.0)共32个,上调基因10个,下调基因22个.在细胞代谢相关基因中,2倍以上(Ratio值小于0.5或大于2.O)差异基因共205个,上调基因86个,下调基因119个.表达差异5倍以上(Ratio值小于0.2或大于5.0)共15个,上调基因10个,下调基因5个.利用基因数据库检索分析发现5个基因与结肠癌转移关系密切.结论:结肠癌的发生和转移是多基因参与的,本实验应用基因微阵列技术发现细胞凋亡和代谢相关基因中发现5个基因与结肠癌转移关系密切.     

应用基因表达谱芯片从不同转移能力的 乳腺癌细胞中筛选转移相关基因

人乳腺癌细胞系 MCF-7 及其转移亚克隆 LM-MCF-7 为肿瘤转移分子机制的研究提供了细胞模型 . 应用基因芯片技术比较两种具有不同转移能力细胞系基因表达谱的差异,寻找乳腺癌转移相关基因 . 提取两种细胞总 RNA ,分别用 Cy5-dCTP 、 Cy3-dCTP 标记 LM-MCF-7 和 MCF-7 的 cDNA ,并与含有 21 329 个基因的芯片进行杂交并扫描,利用 GenePix Pro 4.0 图像分析软件处理数据判断基因是否在两个细胞中存在表达差异 . 经互换荧光标记物重复两次实验,共筛选出差异表达基因 67 个,其中 41 个在 LM-MCF-7 细胞中表达上调, 26 个在 LM-MCF-7 细胞中表达下调 . 应用实时定量 RT-PCR 对 7 个表达差异明显的基因进行了验证 . 生物信息学分析结果提示,上述发现的差异基因编码产物与细胞内信号转导、转录调节、应激反应、新陈代谢、发育、细胞运动、细胞凋亡和细胞粘连等功能有关 . 据文献报道,这些差异表达的基因中有 35 个与肿瘤有关,其中 9 个与乳腺癌转移有关, 6 个可能参与肿瘤浸润和转移过程 . 根据基因芯片检测的结果,从功能上对 LM-MCF-7 细胞和 MCF-7 细胞与细胞凋亡的关系进行了研究,发现具有高转移倾向的 LM-MCF-7 细胞与 MCF-7 细胞相比,抗凋亡能力较强 . 上述与肿瘤转移相关基因在肿瘤转移中的作用及其分子机理有待深入研究 .     

结核分枝杆菌入侵诱导的人巨噬细胞全局性基因表达变化

利用含有12800个基因全长或部分序列的基因芯片研究结核分枝杆菌无毒株入侵导致的人巨噬细胞U937全基因组在转录水平的表达谱变化. 结果表明其中473个基因(3.7%)差异表达, 表达上调的基因25个(5.3%), 上调超过3倍的包括丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶, 可溶性结合半乳糖苷的凝集素, 蛋白质酪氨酸磷酸酶delta, DDR受体酪氨酸激酶等的编码基因, 其余基因(94.7%)表达下调. 表达下调的基因中, 表达仅为原来1/3以下的25个, 其中syndecan 结合蛋白的表达下调12.5倍. 芯片研究结果与结核分枝杆菌一般抑制宿主细胞免疫应答的趋势相符. 这473个基因中的376个基因在GenBank中有记录, 另外97个是新基因. 生物信息学分析提示差异表达基因编码产物与细胞内信号传导、细胞因子反应、细胞骨架重建、细胞凋亡、铁代谢、电子传递、线粒体功能和离子通道等有关. 这些差异表达基因中, 有17个是文献报道过的, 而且都印证了本文的结果. RT-PCR和Northern杂交实验确证了表达谱芯片研究结果. 通过DNA芯片研究全局表达谱变化, 揭示了细菌入侵早期导致的巨噬细胞表达变化, 为深入研究结核分枝杆菌-宿主相互作用提供了基础数据和探索方向.     

cDNA cloning and expression of an apoptosis-related gene, humanTFAR15 gene

By means of cDNA-RDA method, some cDNA fragments were found to have high levels of expression during deprivation of GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating factor) in a human myeloid cell line, TF-1 cells. One of these fragments was identified as a novel gene. To get the full length of cDNA, rapid amplification of cDNA ends (RACE) and expressed sequence tags (EST) overlapping fragments assembling strategies were used. The novel gene was named TRAF15 (TF-1 cell apoptosis related gene-15), which consists of 1 218 nucleotides and encodes 212 amino acids. The putative protein product of TFAR15 is partially homologous toC. elegans protein C14A4.11. TFAR15 mRNA is expressed in fetal liver, kidney, spleen and lung, and also in some human myeloid cell lines. Both of the TFAR15 mRNA and protein were highly expressed in TF-1 cells after GM-CSF withdrawal.In vitro analysis showed that the recombinant TFAR15 protein could inhibit the natural cell death of 293 cells, an embryonic kidney cell line.     

cDNA cloning and expression of an apoptosis-related gene, human TFAR15 gene

By means of cDNA-RDA method. some cDNA fragments were found to have high levels of expression during deprivation of GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating factor) in a human myeloid cell line, TF-1 cells. One of these tragments was identified as a novel gene. To get the full length of cDNA, rapid amplification of cDNA ends (RACE) and expressed sequence tags (EST) overlapping fragments assembling strategies were used. The novel gene was named TRAF15 (TF-1 cell apoptosis related gene-15), which consists of 1218 nueleotides and encodes 212 amino acids. The putative protein protein product of TFAR15 is partially homologous to C. elegans protein C14A4. 11. TFAR15 mRNA is expressed in fetal liver, kidney, spleen and lung. and also in some human myeloid cell lines. Both of the TFAR15 mRNA and protein were highly expressed in TF-(?) cells after GM-CSF withdrawal. In vitro analysis showed that the recombinant TFAR15 protein co(?)ld inhibit the natural cell death of 293 cells, an embryonic kidney cell     

NaHCO3胁迫下紫杆柽柳一些基因的表达

应用差异显示技术研究了NaHCO3胁迫下紫杆柽柳(Tamarix androssowii)基因的表达.经Northern检测共获得了17个基因片段,BLASTX分析表明,有2个基因与编码F-box类蛋白家族成员的基因同源性较高(F-box蛋白的功能为调节细胞周期转变、转录调控和信号转换,在植物抗逆防御系统中起重要作用);1个基因与翻译起始因子eIF成员有高的同源性(eIF在植物和酵母的抗盐胁迫中起重要作用);2个与分泌型过氧化物酶和过氧化物酶基因同源性高的基因片段;5个与盐碱胁迫密切相关的新基因,它们在胁迫前后差异表达明显.另外7个与已知基因同源性较高或有一定相似性,它们在抗盐碱胁迫中的作用尚待研究.     

鼻咽癌上皮细胞株HNE1差异表达基因的分离与鉴定

为了分离鼻咽癌差异表达基因 ,应用抑制性扣除杂交技术 ,在正向抑制性扣除杂交中 ,以鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA作为检测子 ,以人胚鼻咽上皮细胞cDNA作为驱赶子 ;在反向抑制性扣除杂交中 ,以人胚鼻咽上皮细胞cDNA作为检测子 ,以鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA作为驱赶子 ,分别通过抑制性扣除杂交 ,构建了鼻咽癌上皮细胞株HNE1表达下调和表达上调的两个扣除cDNA文库 .从鼻咽癌相关的扣除cDNA文库中随机挑取 1 2 0 0个克隆 ,采用菌落PCR扩增其插入cDNA片段 ,自动点膜制备成cDNA微阵列膜 ,分别用鼻咽癌上皮细胞株HNE1、人胚鼻咽上皮mRNA经逆转录标记cDNA探针 ,分别与cDNA微阵列膜杂交 ,通过杂交信号的自动扫描分析 ,对杂交信号存在 5倍差异的克隆进行测序 ,获得了 1 0个鼻咽癌差异表达基因的cDNA片段 ,其中 3个为新基因序列 ,其GenBank登录号为 :AF5 1 0 1 88、AF5 1 0 1 89和AF5 1 0 1 90 ,7个代表已知基因序列 .采用RT PCR证实S1 0 0A8,CK1 9和RBP1基因在人胚鼻咽上皮中高表达而在鼻咽癌细胞株HNE1中低表达 .这些结果显示上述基因可能是鼻咽癌发生的重要因素     

人红系分化相关基因高表达提高TF-1细胞系存活能力

目的：检测人红系分化相关基因（EDAG）对TF-1细胞株存活能力的影响。方法：采用电转染法将过表达EDAG的质粒高效转染TF-1细胞株,通过G418筛选得到过表达EDAG的TF-1细胞稳定株,用MTs法检测过表达EDAG的细胞稳定株在撤除细胞因子后的增殖情况,用流式细胞术检测细胞凋亡。结果：用表达GFP的质粒电转染TF-1细胞株,通过综合评价转染效率和细胞状态,确定最佳转染条件为1350V电压电击30ms,电击次数为1次;对得到的细胞稳定株进行检测,其内源EDAG的mRNA和蛋白水平均上调;将细胞稳定株在撤除细胞因子状态下培养,过表达EDAG后细胞存活能力增强、凋亡减少。结论：用电转染方式高效转染TF-1细胞,通过筛选得到过表达EDAG的稳定细胞株,并证实撤除细胞因子后过表达EDAG能提高TF-1细胞系的存活及抗凋亡能力。     

mRNA差异展示研究胃癌差异表达基因

以胃癌细胞株GC7901与胃粘膜细胞株GES-1为对比材料,利用mRNA差异展示技术,研究胃粘膜至胃癌过程的差异表达基因,为建立胃癌预警系统打下基础.获得8个未知的与胃癌相关的cDNA,命名为GCYS-1,2,3,4,5,6,7,20,完成其克隆及序列分析,RNA印迹证实GCYS-1至7片段与GCYS-20基因在GC7901细胞株中呈高表达,在GES-1细胞株中呈低表达.此8个序列在GenBank数据库中登录,接受号为AF054162～AF056168及AF219140.     

Stable transformation of insect cells to coexpress a rapidly selectable marker gene and an inhibitor of apoptosis

Summary We have constructed several plasmid expression vectors to express foreign genes in stably transformed insect cells. Unlike baculovirus-based expression vectors by which genes of interest are expressed transiently before lysis of the virus-infected cells, genes can be expressed continuously over many passages in a stable cell line. Furthermore, the function of a gene or genes expressed in a stable cell line from an insect-specific promoter that is constitutively expressed can be studied in the absence of virus infection and viral gene expression. In this study, we have expressed a novel, selectable marker gene, puromycin acetyltransferase, under the control of the Drosophila melanogaster hsp70 promoter or under the control of the AcMNPV ie-1 promoter which is active in Spodoptera frugiperda cells in the absence of virus infection. In addition, we have constructed expression vectors which coexpress two genes from separate promoters, the pac gene which confers resistance to puromycin and a baculovirus gene which inhibits apoptosis, derived from Orygia pseudotsugata nuclear polyhedrosis virus. Both genes were expressed in stable populations of S. frugiperda cells in the absence of continuous drug selection.     

Estrogen-dependent and cell-specific regulation of gene expression in RUCA-I endometrial adenocarcinoma cells

Estrogens are believed to play a crucial role in growth regulation and differentiation of the normal endometrial tissue as well as in the carcinogenesis of the endometrium. Therefore, the influence of estrogens and antiestrogens on gene expression in the estrogen receptor-positive rat endometrial adenocarcinoma cell line RUCA-I was investigated. Differentially expressed genes were detected by differential display PCR of RNA of untreated, estradiol-treated and antiestrogen-treated RUCA-I cells. By means of the PCR technique, 14 differentially expressed fragments could be detected. Three of these 14 differentially expressed fragments were confirmed by Northern blotting. The steady state mRNA levels of the three gene fragments named AH41, AH42 and AH44 were downregulated by the antiestrogen ICI 164384. Further characterization revealed that the fragment AH41 is not expressed in stromal cells but in the human and rodent epithelial cell lines, BG-1 and RUCA-II. A comparison of the cDNA sequence of fragment AH41 with the EMBL database showed no high homology to known genes. Therefore, fragment AH41 has to be regarded as a fragment of a novel, estradiol-sensitive gene.