高通量测序分析小头裸裂尻鱼皮肤和肠道的微生物多样性

【目的】解析小头裸裂尻鱼不同部位的微生物群落结构、物种组成、多样性特征以及菌群功能差异。【方法】通过Illumina MiSeq扩增子高通量测序,分析小头裸裂尻鱼皮肤黏膜、肠道黏膜和肠道内容物3个部位微生物菌群组成差异,并通过Tax4Fun预测菌群潜在功能。【结果】皮肤黏膜微生物α多样性最高,其Shannon指数显著高于肠道黏膜(P<0.05)和肠道内容物(P<0.001)。主坐标分析表明,皮肤黏膜微生物显著区别于其他2个部位。在门水平小头裸裂尻鱼3个部位相对丰度前五的微生物类群均为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和蓝藻门(Cyanobacteria),其中肠道内容物中放线菌门相对丰度(46.53%)显著高于肠道黏膜(29.23%,P<0.05)和皮肤黏膜(25.83%,P<0.01);肠道黏膜中变形菌门的相对丰度(40.33%)显著高于肠道内容物(26.10%,P<0.05)。对各部位相对丰度前10的菌群进行分析发现,小头裸裂尻鱼皮肤黏...     

温州市境内城市河流底泥氨氧化菌富集培养物微生物群落结构分析

【背景】城市河流底泥含有丰富的微生物资源,底泥表面更是硝化作用的主要位点之一,其表面微生物在河流生态系统氮的转化过程中发挥着重要作用。【目的】以温州市境内的城市河流水系温瑞塘河茶山段舜岙河和横江河的4条河道作为采样点,比较分析4种不同环境下城市河流表层底泥氨氧化菌富集培养物的微生物群落结构。【方法】通过野外采样及室内培养对底泥中氨氧化功能菌进行富集培养,采用高通量测序技术分析微生物群落的组成、丰度和多样性。【结果】富集培养后主要优势类群为变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。4个样品共涉及氨氧化细菌3个属,分别为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus),涉及氨氧化古菌1个属为Nitrososphaera,其中所有样品均以Nitrosomonas为主。不同底泥富集样品氨氧化微生物可操作分类单元(Operational taxonomic unit,OTU)组成存在明显差异,栽种有水生植物的河道底泥样品DA2具有最高的氨氧化细菌OTU数量和相对丰度,而存在生活餐饮污染的河道底泥样品DA4具有最高的氨氧化古菌OTU数量和相对丰度;相较于滞留水体,采自相对流动水体的富集样品DA2、DA4具有更高的氨氧化微生物OTU数量和相对丰度。【结论】阐述了4种不同环境下城市河流底泥氨氧化菌富集培养物微生物群落结构的多样性,确定了富集培养之后的优势类群,为氨氧化微生物培养源的选择提供了参考,也为城市河流底泥中氨氧化菌进一步的筛选分离及其生理生态特征的研究提供了科学依据。     

环梅山岛海域春季浮游古菌群落空间分布特征研究

【目的】海洋浮游古菌是生物地球化学循环的关键驱动者,但其在近岸海域的水平空间分布特征还未被充分了解。本研究以与陆地紧密相连的环梅山岛海域为例研究浮游古菌在海陆过渡带的水平分布模式。【方法】利用16S rRNA基因扩增子测序,以期从优势类群分布、群落组成变化和物种共现模式3个层面揭示梅山湾潟湖区和临近海域春季浮游古菌的空间分布特征。【结果】该海域浮游古菌在原核生物群落中的相对丰度为0.6%–26.5%,向海侧古菌丰度显著高于潟湖区。浮游古菌群落由奇古菌门Marine Group(MG)I和广古菌门MGII主导,MGI的物种组成较为单一,而MGII的系统发育多样性较高。古菌群落的空间分布受同质扩散、环境选择和非主导过程(包括生态漂变)的共同塑造,其中环境选择主要由悬浮颗粒物、硝酸盐、溶解氧、水温和铵盐驱动。通过网络分析发现MGI与红杆菌科细菌呈广泛的负相关,MGII则普遍与SAR11、SAR116和SAR86等异养细菌类群呈正相关。【结论】本研究初步揭示了环梅山岛海域春季浮游古菌群落的空间分布特征及其调控因子,拓展了对古菌在海陆过渡带分布规律的认识。     

不同品种苹果树内生细菌群落多样性及功能

【背景】目前苹果树内生细菌的研究较多,但对不同品种苹果树内生细菌群落多样性分析比较的相关报道还较少。【目的】通过分析比较新疆本地和吉尔吉斯斯坦引进的8个不同品种苹果树内生细菌群落多样性的差异,可以充分挖掘其蕴含的丰富微生物资源。【方法】采用MiSeq高通量测序技术分别测定不同品种苹果树内生细菌群落16S rRNA基因V3-V4区序列并进行生物信息学分析。【结果】不同品种苹果树中获得的V3-V4区有效序列数在61487-71583条之间,聚成24-92个操作分类单元(operationaltaxonomicunit,OTU),Shannon指数和Simpson指数分别在0.729-1.177和0.265-0.457之间,新疆本地品种的苹果树内生细菌种类和多样性高于吉尔吉斯斯坦品种。内生细菌种群分析结果表明,变形菌门和放线菌门的OTU总计分别覆盖了不同品种苹果树内生细菌的61.16%-97.08%,为苹果树的主要优势细菌门。优势细菌属数目、组成及其丰度随苹果品种的不同而有所差异。马赛菌属(Massilia)和节杆菌属(Arthrobacter)的总丰度最高,其丰度分别在6.06%-71.37%、1.29%-17.86%之间,且优势细菌属中存在具有一定促生抗逆或与降解环境有毒有害物质相关的有益功能性状的微生物类群。群落功能预测分析初步显示不同品种的苹果树内生细菌群落功能有所差异,新疆本地品种微生物群落的功能信息多于吉尔吉斯斯坦品种,主要体现在化能异养、需氧化能异养、尿素分解、砷酸盐解毒和异化砷还原等功能方面。此外,这8个品种苹果树内生菌中可能还存在大量的未知属,其范围在13.74%-69.60%之间。【结论】不同品种苹果树内生细菌群落多样性较为丰富,种群组成和功能存在较大差异,且潜在分类信息也给新的微生物资源挖掘和功能分析提供线索,值得进一步研究。     

滴灌对苜蓿根际土壤细菌多样性和群落结构的影响

【背景】细菌作为土壤微生物中的重要类群,能够有效促进土壤物质循环和能量流动,细菌多样性以及群落结构能够反映土壤的质量状况。【目的】了解滴灌条件下苜蓿根际土壤细菌群落结构及多样性变化,探讨土壤环境因子对细菌群落结构的影响。【方法】基于细菌16Sr RNAV3-V4区高通量测序技术,分析比较滴灌与自然降雨两种模式下生长的苜蓿根际与非根际土壤中细菌多样性和群落分布规律,然后采用冗余分析(Redundancy analysis,RDA)探讨土壤环境因子与细菌多样性的关系。【结果】苜蓿根际土壤中细菌多样性丰富,滴灌根际土壤中细菌多样性显著高于自然降雨根际土壤;土壤样品中共检测到细菌46门53纲116目220科469属,主要的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria,25.27%-34.42%),其中α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,11.41%-18.97%)为优势亚群,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas,1.00%-4.54%)为优势属。相较于自然降雨,滴灌条件下苜蓿根际土壤细菌的6个门和16个属的群落结构发生显著变化;此外,RDA分析表明,不同环境因子对微生物群落的影响不同,滴灌根际土壤中9个细菌属的丰度与全磷、全钾、有效磷、碱解氮、有机质、土壤中性磷酸酶以及土壤脲酶的含量显著正相关。【结论】滴灌作为新型节水技术,在促进植物生长、提高产量、节约成本的基础上增加了植物根际土壤中细菌多样性和丰度,该结果为新型灌溉体制的改革以及土壤微生物资源的开发利用提供科学数据。     

大兴安岭典型永久冻土土壤细菌群落组成和多样性

【背景】土壤微生物是土壤生物中的重要成分,参与了土壤生态系统中关键的生物化学循环过程。但是关于寒温带多年冻土土壤微生物的研究还比较薄弱。【目的】探究大兴安岭多年冻土土壤中微生物的多样性和种群结构。【方法】利用MiSeq高通量测序技术对黑龙江大兴安岭地区呼中保护区落叶松冻土和樟子松林冻土土壤样品进行测序。【结果】在落叶松冻土和樟子松林冻土土壤中,相对丰度最高的优势菌群的组成基本一致,在门水平有疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿菌门(Chlorobi)、Parcubacteria、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)10个细菌门类,其中,疣微菌门(Verrucomicrobia)在樟子松林土壤中的相对丰度较多,变形菌门(Proteobacteria)在落叶松林土壤中的相对丰度较多。通过α多样性分析可知,落叶松冻土土壤微生物的群落多样性高于樟子松林冻土,而且两者的细菌群落组成与结构差异性较大。【结论】为深入认识大兴安岭多年冻土区的土壤微生物群落结构组成以及影响因素提供数据支撑。     

大叶藻(Zostera marina)海草床沉积物细菌和古菌丰度及组成的垂直剖面特征

【背景】海草床是重要的"蓝碳"生态系统,对全球碳汇有重要贡献。海草床沉积物剖面的垂直梯度特征显著,表层呈现氧化态,富含活性有机质,而深层呈还原态,以惰性有机质为主。【目的】探究这种垂直特征如何影响微生物的丰度和群落分布。【方法】利用荧光定量PCR和16SrRNA基因高通量测序等手段,测定了山东荣成天鹅湖大叶藻海草床不同深度(5、10、15、20、25和30 cm)沉积物中细菌和古菌丰度、多样性和群落结构的变化。【结果】细菌和古菌16S rRNA基因拷贝数随深度的增加而降低,在沉积物5cm深处,细菌的16SrRNA基因拷贝数显著高于20cm和30cm层(ANOVA,P0.05)。深度对细菌和古菌α多样性指数没有显著影响(P0.05)。细菌中相对丰度最高的是变形菌门,其次是绿弯菌门,拟杆菌门,浮霉菌门等,其中δ-变形菌和浮霉菌的相对丰度随深度显著增加(P0.05)。古菌群落中深古菌门比例最高,在25cm深处达到70%以上;其次是乌斯菌门、洛基古菌门、广古菌门和奇古菌门等。奇古菌门比例随深度增加而显著降低(P0.05),其他古菌类群在不同深度间差异不显著(P0.05)。【结论】海草床沉积物细菌和古菌的丰度、多样性和群落分布具有明显的垂直特征,这种特征可能受沉积物有机质组成和氧化还原状况影响。     

河套平原不同深度高砷地下水硫酸盐还原菌群落分布特征及环境意义

【目的】探究不同深度的高砷含水层中硫酸盐还原菌的丰度、群落组成和多样性的差异,并结合硫酸盐硫同位素等多种水化参数,揭示不同深度高砷地下水中硫酸盐还原菌群落分布特征及其环境意义。【方法】以我国典型高砷地下水分布区河套平原为研究区,采集不同深度含水层中的高砷地下水样品,测定水化参数,采用qPCR对样品16S rRNA基因和dsrB基因进行定量;通过dsrB基因高通量测序对硫酸盐还原菌群落进行分析,并将dsrB基因相对丰度、群落组成及多样性与水化因子结合,进行统计学分析。【结果】基于dsrB基因的定量结果表明,浅层地下水中dsrB基因相对丰度高于深层地下水。浅层地下水中,dsrB基因相对丰度与CH₄浓度呈显著正相关,且δ³⁴S-SO₄^2–与CH₄浓度显著正相关。而深层高砷地下水中,dsrB基因相对丰度与SO₄^2–浓度、DOC浓度存在显著正相关性。高通量测序结果表明,深层地下水中硫酸盐还原菌的α多样性显著高于浅层地下水。研究区内硫酸盐还原菌可...     

微生物暗物质分离培养——以CPR和DPANN类群为例

候选门级辐射类群(candidate phyla radiation, CPR)细菌和DPANN超门古菌是重要的微生物暗物质，约占地球细菌和古菌多样性的一半。目前对于CPR和DPANN的研究处于起步阶段，仅获得了少数的实验室培养菌株，代表着丰富的菌种资源和基因资源的潜力；同时其生态功能还未知，预示着未来新发现的巨大机遇。本文在总结现有微生物分离培养方法以及CPR和DPANN菌株共性特征的基础上，对已实现实验室培养的CPR和DPANN菌株进行归纳和分析，提出该类群菌株分离培养的几点建议，以期为今后对该类群菌株的分离培养提供参考。CPR细菌和DPANN古菌的可培养研究有助于加深对该类群菌的认识，阐明其生活方式、进化及演变规律并揭示其独特的代谢途径及功能基因，发现新的天然活性产物，具有重要的科学意义及应用价值。     

基于高通量测序技术分析使它隆对玉米土壤细菌多样性的影响

【目的】研究使它隆对玉米土壤细菌多样性的影响。【方法】利用Illumina Miseq高通量测序技术,分别测定了玉米土壤细菌的16S rRNA基因的V4-V5可变区序列,进而对不同时期的不喷施除草剂和喷施除草剂的玉米土壤中细菌群落组成和多样性进行分析。【结果】研究共获得260940条有效序列,167191条优质序列,12656个OTUs。多样性分析结果表明,使它隆处理10 d后的土壤细菌多样性和丰度降低;使它隆处理60 d后的土壤细菌多样性和丰度提高。对土壤细菌群落组成分析发现,5个土壤样品中的优势菌门均为酸酐菌门、变形菌门、放线菌门、绿弯菌门和芽单胞菌门。使它隆处理10 d后的样品酸杆菌门的比例增加,放线菌门和绿弯菌门的比例降低;使它隆处理60 d后样品变形菌门的比例降低,绿弯菌门的比例明显增加。【结论】使它隆对玉米土壤细菌多样性产生一定影响,其影响随施药时间而异。     

单分子测序技术及应用研究进展

从DNA双螺旋结构的发现开始,生命科学研究进入分子水平,在20世纪70年代出现的测序技术为破译遗传密码作出了巨大贡献.近几年出现的单分子测序技术,可以在单个分子水平读取核苷酸序列,也被称为第三代测序技术,主要代表有HeliScope、Nanopore和PacBio等.与传统的第一代和第二代测序技术相比,第三代测序能够产生更长的碱基读长,能直接对RNA进行测序,无需逆转录,测序速度极快,同时其中某些技术所涉及的设备可以小型化,可便携至野外现场测序.第三代测序技术在生命科学基础理论研究及生物医学临床实践中,具有广泛的应用.本文重点介绍了各种单分子测序技术的原理、优缺点,及其应用研究进展.     

新一代测序技术的研究进展

大规模DNA测序技术是揭秘人类和其它生物遗传密码的重要技术,在分子生物学和基础医学领域有广泛应用。第二代测序技术的出现使DNA测序的通量大幅提高,测序的成本大幅下降,原来只有在大型测序中心才能完成的测序任务现在已经可以在更多的实验室展开。但是,早期的第二代测序技术仍然存在诸如文库构建过程复杂、测序成本依然较高等缺点。为了克服上述缺点,近三年发展了几种新的第二代和第三代测序技术,这些技术不仅继承了早期第二代测序技术通量高的优点,而且在文库构建等方面取得了重要突破,进一步简化了测序操作,降低了测序成本,缩短了测序时间。本文就几种最新的大规模测序技术的原理、特点与发展趋势进行简要介绍。     

Commercial high-throughput sequencing and its applications in DNA analysis

DNA sequences can be used for the analysis of genetic variation and gene function. The high-throughput sequencing techniques that have been developed over the past three years can read as many as one billion bases per run, and are far less expensive than the traditional Sanger sequencing method. Therefore, the high-throughput sequencing has been applied extensively to genomic analyses, such as screening for mutations, construction of genomic methylation maps, and the study of DNA-protein interactions. Although they have only been available for a short period, high-throughput sequencing techniques are profoundly affecting many of the life sciences, and are opening out new potential avenues of research. With the highly-developed commercial high-throughput sequencing platforms, each laboratory has the opportunity to explore this research field. Therefore, in this paper, we have focused on commercially-popular high-throughput sequencing techniques and the ways in which they have been applied over the past three years.     

DNA测序技术概述

DNA测序技术作为现代生命科学研究的核心技术之一,自上世纪70年代中期DNA发明以来发展迅速。我们简要综述现有的几代DNA测序技术的原理及其发展历程,并对未来可能出现的第三代测序进行预测。     

高通量测序技术及其应用

高通量测序技术是DNA测序发展历程的一个里程碑,它为现代生命科学研究提供了前所未有的机遇。详细介绍了以454、Solexa和SOLiD为代表的第二代高通量测序技术,以HeliScope TIRM和Pacific Biosciences SMRT为代表的单分子测序技术,以及最近Life Science公司推出的Ion Personal Genome Machine (PGM)测序技术等高通量测序技术的最新进展。在此基础上,阐述了高通量测序技术在基因组测序、转录组测序、基因表达调控、转录因子结合位点的检测以及甲基化等研究领域的应用。最后,讨论了高通量测序技术在成本和后续数据分析等方面存在的问题及其未来的发展前景。     

An integrative approach for the optical sequencing of single DNA molecules

A new approach for optically sequencing ensembles of single DNA molecules using DNA polymerase to mediate the consecutive incorporation of fluorochrome-labeled nucleotides into an array of large single DNA molecules is presented. The approach utilizes cycles of labeled fluorochrome addition, detection to count incorporations, and bleaching to reset the counter. These additions are imaged and analyzed to estimate the number of labeled additions and to correlate them on a per-locus basis along DNA backbones. Initial studies used precisely labeled polymerase chain reaction products to aid the development and validation of simple models of fluorochrome point spread functions within the imaging system. In complementary studies, nucleotides labeled with the fluorochrome R110 were incorporated into surface-elongated lambda DNA, and fluorescent signals corresponding to the addition of R110-dUTP were counted and assigned precise loci along DNA backbones. The labeled DNAs were then subjected to photobleaching and to a second cycle of addition of R110-labeled nucleotides-a second round of additions was correlated with the first to establish strings of addition histories among the ensemble of largely double-stranded templates. These results confirm the basic operational validity of this approach and point the way to the development of a practical system for optical sequencing.     

Sequencing Strategies for Fusion Gene Detection

Fusion genes formed by chromosomal rearrangements are common drivers of cancer. Recent innovations in the field of next-generation sequencing (NGS) have seen a dynamic shift from traditional fusion detection approaches, such as visual characterization by fluorescence, to more precise multiplexed methods. There are many different NGS-based approaches to fusion gene detection and deciding on the most appropriate method can be difficult. Beyond the experimental approach, consideration needs to be given to factors such as the ease of implementation, processing time, associated costs, and the level of expertise required for data analysis. Here, the different NGS-based methods for fusion gene detection, the basic principles underlying the techniques, and the benefits and limitations of each approach are reviewed. This article concludes with a discussion of how NGS will impact fusion gene detection in a clinical context and from where the next innovations are evolving.