乳酸乳球菌Nisin抗性基因nisI的克隆及作为筛选标记的研究

摘要：【目的】为了优化LJ1菌株的培养条件使之产生高活性的胞外褐藻胶裂解酶。【方法】通过富集培养技术从海带筛选到一株褐藻胶裂解酶产生菌LJ1, 依据表型特征、脂肪酸组成分析及16S rRNA基因序列分析对该菌株进行鉴定。通过单因子和正交试验对LJ1 菌株产胞外褐藻胶裂解酶的培养条件进行了优化。【结果】LJ1菌株属于假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）。该菌株产酶的最佳培养基组成为：褐藻胶3 g/L、(NH4)2SO4 3 g/L、NaCl 20 g/L、KH2PO4 0.1 g/L、CaCl2 0.1 g/L;最佳培养条件为：250 mL三角烧瓶中装液量25 mL、接种量3%、摇瓶转速150 r/min、pH7.5、培养温度为28℃、培养时间为24 h。LJ1菌株所产褐藻胶裂解酶的最适温度为40℃,最适pH7.6,最适NaCl浓度为0.3 mol/L。1 mol/L金属离子Mg2+对酶活力有明显的促进作用,而Co2+ 和Zn2+对酶活力有较强的抑制作用。【结论】LJ1菌株是Pseudoalteromonas 新的胞外褐藻胶裂解酶产生菌,在最佳培养条件下,该菌株的酶活力提高了66%。     

假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp. AJ5 产k-卡拉胶酶的培养条件优化

[目的]本研究的目的是优化Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株的培养条件使之产生高活性的胞外κ-卡拉胶酶.[方法]通过富集培养技术从刺参肠道分离出一株卡拉胶降解菌AJ5,该菌株能利用卡拉胶作为惟一碳源和能源.依据形态学和生理学特征及16S rRNA基因序列分析,将该菌株鉴定为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas).通过单因素试验和正交试验对Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株产胞外κ-卡拉胶酶的培养条件进行了优化.[结果]单因素试验结果表明,Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株的最佳培养条件为250 mL三角瓶装入75 mL发酵培养基、摇床转速150 r/min、接种量7%、pH8.0.单因素试验和正交试验结果显示该菌株的最佳培养基组成为κ-卡拉胶 1 g/L、牛肉膏2 g/L、 NaCl 20 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、 MnCl2· 4H2O 0.2 g/L、 FePO4 · 4H2O 0.01 g/L; 培养温度为28℃,培养时间为28 h.[结论]Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株分泌胞外κ-卡拉胶酶,在最佳培养条件下,该菌株的κ-卡拉胶酶活力比优化前提高了4倍.     

产褐藻胶裂解酶菌株HB12274的鉴定和发酵优化

鉴定一株从红树林土壤中分离的产褐藻胶裂解酶菌株HB12274,并优化其培养条件使之产生高活性的胞外褐藻胶裂解酶。依据形态学、生理生化特性和16S rDNA序列分析对菌株HB12274进行鉴定;设计单因素和正交试验优化菌株HB12274产胞外褐藻胶裂解酶的培养条件。菌株HB12274鉴定为解淀粉芽孢杆菌植物亚种Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum;菌株HB12274产褐藻胶裂解酶的最适发酵条件为:褐藻酸钠5.0 g/L、蛋白胨6.0 g/L、Na Cl 15.0 g/L、CaCl21.0 g/L、初始pH6.0,30℃发酵培养42 h。在最优培养条件下,菌株HB12274最大酶活性可达721.2 U/mL,与优化前酶活力相比提高了2.95倍。本研究获得菌株Bacillus amyloliquefaciens HB12274的最适产酶条件,为该菌的进一步研究应用提供参考。     

响应面法优化类芽胞杆菌HB172198产褐藻胶裂解酶发酵培养基

为了提高类芽胞杆菌新种HB172198产褐藻胶裂解酶活力,本研究采用响应面法对该菌株液体发酵培养基进行了优化实验。在单因素实验和Plackett-Burman试验筛选出海藻酸钠、胰蛋白胨、NaCl、MgSO4·7H2O等4个显著影响产酶因素的基础上,通过Box-Behnken设计及响应面法进行回归分析,得出产褐藻胶裂解酶最佳发酵培养基,其成分为:海藻酸钠7.50 g/L、胰蛋白胨13.57 g/L、NaCl 29.75 g/L、MgSO4·7H2O 0.08 g/L。优化条件下该菌株最大酶活性达14.60 U/mL,是优化前的1.87倍。本研究为菌株HB172198产褐藻胶裂解酶的大规模生产和工业应用提供了重要的理论依据。     

褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化

对一株从腐烂海带中筛选得到的产褐藻胶裂解酶的菌株进行鉴定,并对其产酶条件进行发酵优化。经形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定,将其鉴定为盐单胞菌属,并命名为Halomonas sp. WF6。通过在摇瓶培养水平上进行单因素和多因素正交试验,确定褐藻胶裂解酶产生菌WF6的最适产酶培养基为：褐藻酸钠6.0 g/L,蛋白胨5.0 g/L,酵母粉2.5 g/L,NaCl 30 g/L,K⁺ 5 mmol/L。进而采用最适培养基进行产酶条件的优化,优化后的发酵产酶条件为：初始pH 8.0,培养温度25℃,接种量为2%,摇瓶装液量30 ml/250 ml,培养时间39 h。优化后的褐藻胶裂解酶酶活达117.66 U/ml,是优化前的2.1倍。该酶对褐藻酸钠的酶解产物主要由聚合度为二和三的褐藻寡糖组成。     

褐藻胶降解菌的筛选、鉴定及产酶条件优化

【目的】筛选一株能降解褐藻胶的菌株,并优化产酶条件以提高褐藻胶裂解酶活力。【方法】从漳州海域采集到海水和海泥,以海藻酸钠为唯一碳源,通过富集培养、初筛、复筛筛选到一株能够降解褐藻胶的菌株。依据16S rRNA序列分析、生理生化特征、菌体形态及菌落特征对该菌进行鉴定。通过单因素和正交试验对该菌的产酶条件进行优化。【结果】该菌属于海科贝特氏菌,命名为Cobetiamarina HQZ08。该菌株最佳的产酶培养基组成为:海藻酸钠7.00g/L、蛋白胨3.00g/L、NaCl30.00g/L,K2HPO4·3H2O 1.25 g/L。最佳发酵条件为:接种量2%,接种龄12 h,培养基起始pH为7.0,培养温度25°C,培养时间24 h。优化后褐藻胶裂解酶活力达到68.5 U/mL,TLC法分析酶解产物为褐藻胶寡糖。【结论】HQZ08菌株可以用于降解褐藻胶,产生聚合度为2–6的褐藻胶寡糖。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质

【目的】克隆交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)BYS-2的褐藻胶裂解酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源表达,对分离纯化的重组酶进行酶学性质研究。【方法】以交替假单胞菌BYS-2菌株基因组DNA为模板,克隆得到褐藻胶裂解酶基因alg738,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-alg738,诱导表达,表达产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应p H为8.0,在p H 6.0-9.0范围内37°C保温1 h仍能保持84%以上的相对酶活力,具有较好的p H稳定性;最适反应温度为45°C,热稳定性实验显示在37°C下保温60 min其残余酶活力仍达66.6%;在5 mmol/L浓度下,Na~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有明显的促进作用,Ni~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、EDTA、β-巯基乙醇、SDS具有明显的抑制作用。动力学参数Km、Vmax分别为1.11 g/L和0.011 g/(L·min),底物特异性分析表明该重组酶为偏好聚甘露糖醛酸钠(Poly M)裂解作用的双功能酶。【结论】重组褐藻胶裂解酶具有良好的酶学特性,为褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。     

1株褐藻胶降解菌的筛选、鉴定及产酶条件优化

为获得可产生褐藻胶裂解酶并高效降解褐藻胶的菌株,以海藻酸钠为唯一碳源配制培养基,以透明圈法进行初筛,DNS法复筛,从海洋生物中筛选得到1株高酶活力褐藻胶降解菌株B12,经16S rDNA序列分析、生理生化试验、电镜观察,确定该菌为弧菌属(Vibrio sp.)。通过单因素试验及响应面优化试验对影响菌株生长和产酶条件的5个因素(发酵初始pH值、发酵温度、NaCl质量浓度、接种量和装液量)进行优化。得到该菌株最佳产酶条件:pH 6.52,发酵温度28.2℃,NaCl质量浓度20.1 g/L,接种量2.1%,装液量59.5 mL。在最佳发酵条件下,B12菌株酶活力可达91.68 U/mL,相比于优化前提高了38.5%。菌株开始产酶时间提前6 h, 4℃冷藏酶活力稳定性较好。     

海藻酸裂解酶高产菌株Microbulbifer sp.SH-1的分离、鉴定及其产酶条件优化

【目的】筛选一株海藻酸裂解酶高产菌株,并通过优化产酶条件提高海藻酸裂解酶活性。【方法】以海藻酸钠为唯一碳源的培养基,对福建漳州滨海土壤中的微生物进行筛选和分离,获得海藻酸裂解酶高产菌株;依据形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析对目的菌株进行鉴定;然后通过单因素和正交试验对其产酶条件进行优化。【结果】十六烷基吡啶(CPC)染色得到4株透明圈与菌落直径比值(D/d)3的菌株;DNS法测定4菌株发酵液中海藻酸裂解酶活力,其中菌株SH-1的海藻酸裂解酶活性最高,达到315.52 U/mL;经形态、生理生化和16S rDNA测序鉴定,将其命名为Microbulbifer sp. SH-1;通过单因素和正交试验优化,确定该菌株最适产酶培养基为:海藻酸钠10 g/L,NaCl 5 g/L,(NH_4)_2SO_45g/L,MgSO_40.2g/L,K_2HPO_41g/L,FeSO_40.02g/L。对培养条件的进一步优化结果发现,在初始pH 7.5、温度32°C条件下,以1%的接种量将SH-1菌株接入50 mL优化培养基中,240 r/min转速下振荡培养24 h,SH-1菌株产酶最大活性可达757.90 U/mL,比优化前提高了2.4倍。【结论】SH-1最佳产酶条件的建立,为海藻酸裂解酶的大规模制备以及更深层次研究提供了试验基础和理论依据。     

产褐藻胶裂解酶交替单胞菌的发酵优化及alg2951的外源表达

褐藻胶裂解酶是制备生物活性寡糖的重要功能酶,在食品、农业、工业等行业中具有重要应用价值。本研究以交替单胞菌属新种HB161718为出发菌株,在单因素实验基础上,通过Box-Behnken设计及响应面法优化获得该菌的最佳产酶培养基:海藻酸钠7.23 g/L,蛋白胨7 g/L,NaCl 23.11 g/L,K_2HPO_40.1 g/L,MgSO_40.1 g/L,优化条件下酶活力为(54.28±3.47) U/mL,达到优化前的1.59倍。为进一步提高酶活性,通过分子生物学方法实现了褐藻胶裂解酶alg2951在大肠杆菌中的外源表达,纯化后的酶活性为636 U/mL,达到原始菌株酶活的18.6倍。本研究为褐藻胶裂解酶的工业生产提供了新的来源。