猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的克隆及高效表达*

本试验参照GenBank公布的Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)VR2332株的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,应用RT-PCR方法扩增出了PRRSV的核衣壳蛋白基因(N基因).在对N基因及pET32a载体双酶切后进行连接,构建了高效原核表达载体pETN.将pETN重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌后,对培养条件及诱导表达条件(IPTG最佳浓度、作用时间)等影响表达的因素进行优化,实现了PRRSV核衣壳蛋白基因的高效表达.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达研究

采用RT-PCR方法自猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组分离出核衣壳蛋白基因(orf 7),克隆到pMD18-T载体构建成重组质粒pMD18N并进行测序比较,结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与PRRSV美洲型ATCC VR-2332株的同源性为100%,表明orf 7 是PRRSV基因组内很保守的序列;将orf 7亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,构建成重组质粒pGEX-KGN,用pGEX-KGN转化表达菌株BL21,经SDS-PAGE和 Western-blot分析表明克隆在谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子量约为41kDa,并且有免疫学反应活性;这为猪繁殖与呼吸综合征的血清学诊断方法的建立打下了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的克隆及高效表达

本试验参照GenBank公布的Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)VR2332株的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,应用RT-PCR方法扩增出了PRRSV的核衣完蛋白基因(N基因)。在对N基因及pET32a载体双酶切后进行连接,构建了高效原核表达载体pETN。将PETN重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌后,对培养条件及诱导表达条件(IPTG最佳浓度、作用时间)等影响表达的因素进行优化,实现了PRRSV核衣壳蛋白基因的高效表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达研究

采用RT—PCR方法自猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组分离出核衣壳蛋白基因(ofr7),克隆到pMDl8—T载体构建成重组质粒pMDl8N并进行测序比较,结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与PRRSV美洲型ATCCVR—2332株的同源性为100％,表明ofr7是PRRSV基因组内很保守的序列;将ofr7亚克隆到原核表达载体pGEX—KG,构建成重组质粒pGEX—KGN,用pGEX—KGN转化表达菌株BL21,经SDS—PAGE和Western-blot分析表明：克隆在谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST—N分子量约为41kDa,并且有免疫学反应活性;这为猪繁殖与呼吸综合征的血清学诊断方法的建立打下了基础。     

SARS冠状病毒核衣壳(N)蛋白不同区域的原核表达

利用大肠杆菌表达系统对SARS冠状病毒的核衣壳(N)蛋白全长及N末端或／和C末端缺失突变体进行了表达,共表达了39个重组蛋白,表达量在15％～30％之间。分别利用电洗脱或金属鳌合介质纯化重组蛋白,用蛋白印迹实验检测纯化蛋白对SARS病人恢复期血清的反应性,结果发现全长N蛋白活性最好,其余的末端缺失蛋白均无法达到同—：活性水平。由此说明N蛋白的完整性对于其优势表位的充分暴露是必要的。     

基于猪德尔塔冠状病毒重组核衣壳蛋白的ELISA抗体检测方法的建立与评价

【目的】猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发现的一种猪肠道冠状病毒,2014年首次暴发于美国,随后亚洲多个国家也相继报道,对养猪业构成了巨大威胁。以大肠杆菌表达纯化的PDCoV重组核衣壳(N)蛋白为包被抗原,建立检测PDCoV抗体的间接ELISA方法,为PDCoV的血清抗体检测和流行病学调查提供工具。【方法】以PDCoV CHN-HN-2014株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增PDCoV核衣壳蛋白(N)基因的全长cDNA,将其插入原核表达载体pET-30a中,构建原核表达质粒p ET30a-N,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,以纯化的重组N蛋白为包被抗原,建立PDCoV N-ELISA抗体检测方法,评估其特异性、敏感性、稳定性,并用于临床血清的检测。【结果】SDS-PAGE电泳检测证实表达的重组N蛋白主要以可溶性形式存在,Western blotting证实表达的重组蛋白具有反应活性。用纯化的重组蛋白建立的N-ELISA具有良好的特异性、敏感性、稳定性。与中和试验同时检测148份免疫猪血清和102份临床血清,两种方法的阳性符合率为88.99%,阴性符合率为92.90%,总符合率为91.20%。用建立的ELISA方法检测267份临床血清,PDCoV抗体阳性血清的比率为66.67%。【结论】建立的猪德尔塔冠状病毒N-ELISA抗体检测方法与中和试验的符合率高,可用于PDCoV血清抗体检测和流行病学调查。     

棉花GhCOMT1基因原核表达载体构建及蛋白纯化和Western鉴定

为进一步研究GhCOMT1基因的功能,构建了原核表达载体pET-28a-GhCOMT1,酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.2mmol/L IPTG浓度条件下分别进行不同温度梯度诱导,用蛋白标记亲和层析柱(His TrapTM HP)对重组蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。结果表明:16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达,其中16℃诱导12h的蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测目的蛋白相对分子量约为39.748kD;Western blotting分析表明,目的蛋白能与His多克隆抗体起特异性反应。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因克隆及在E.coli中的表达

核衣壳蛋白基因 (N基因 )是传染性支气管炎病毒的重要结构基因 .根据已报道的序列设计引物 ,利用RT PCR技术从病毒RNA中扩增和克隆到了N基因的cDNA ,并测定了核苷酸序列 .克隆的N基因片段ORF全长 12 30bp ,编码 4 0 9个氨基酸 .将该片段序列与其他IBV病毒株比较 ,核苷酸的同一性为 87 0 %～ 98 6 %,氨基酸的同一性为 91 0 %～ 98 1%.将该cDNA亚克隆到pBV2 2 0表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α菌株 ,Western印迹检测 ,获得了分子量约 4 5kD表达蛋白     

SARS病毒核衣壳蛋白、膜蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化

通过反转录PCR获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(M)基因,其序列分析结果与加拿大多伦多株完全一致。将M基因和N基因克隆到大肠杆菌表达载体pET22b和pBV222上,并在大肠杆菌中以包涵体及可溶形式获得高效表达。通过离子交换、金属螯合层析纯化获得电泳纯制品。所获得的核衣壳蛋白具有良好的抗原性,可用于抗SARS抗体检测及亚单位疫苗研究。     

壳聚糖酶的克隆表达与壳寡糖的制备分析

目的:克隆壳聚糖酶基因于大肠杆菌中实现高表达,制备壳寡糖。方法:以枯草芽孢杆菌总DNA为模板扩增壳聚糖酶基因(CSN),克隆至载体pET23a(+)上,转化菌株BL21(DE3)。重组子经0.5 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE和质谱检测与鉴定重组酶。酶纯化后水解壳聚糖,薄层色谱分析其水解产物。结果:质谱证明壳聚糖酶(31.5kDa)成功表达,表达量占菌体总蛋白的45%左右。纯化后重组酶浓度为900 mg/L,纯度95%、回收率85%,酶活力为10 000 U/mg。壳聚糖降解产物为壳二糖至壳四糖。结论:原核表达载体pET23a(+)-CSN构建正确,壳聚糖酶表达量与活性高,适用于水解壳聚糖制备壳寡糖。     

国内外蝗害治理技术现状与展望

本文首先概述了国内外蝗虫发生与为害的态势,总结了现阶段我国蝗虫发生与为害的主要特点:即农田飞蝗暴发频繁而且严重,草原土蝗的发生时常造成严重的经济损失,而且侵入城市干扰市民生活,我国与周边国家之间蝗虫过境迁移频繁,使用化学农药污染环境和农产品;分析了国内外蝗虫防治对策与技术的发展现状,重点介绍了应急防治和可持续治理对策、...     

放牧对牧草光合作用、呼吸作用和氮、碳吸收与转运的影响

研究放牧对草地植物生理活动的影响,对于揭示草地放牧演替的生理机制有重要意义.大量研究表明,家畜放牧对牧草光合作用、呼吸作用以及C和N吸收与转运的影响,可以分为生理伤害和生理恢复2个阶段.放牧通过改变草地冠层结构影响牧草光合作用,净光合作用速率短期内迅速下降,随着叶面积指数增加又逐渐上升,呼吸作用有相似的变化趋势.牧草放牧后再生长所需的C和N最初主要来自根系和留茬中的贮藏物质,此后随着牧草生长恢复逐渐由同化作用供给,C代谢与土壤N水平负相关.放牧后牧草生理活动变化与牧草遗传特性、种间竞争、家畜放牧特征、非生物环境等因素密切相关.     

Kinetics and thermodynamics of peroxidase- and laccase-catalyzed oxidation of N-substituted phenothiazines and phenoxazines

N -substituted phenothiazines (PTs) and phenoxazines (POs) catalyzed by fungal Coprinus cinereus peroxidase and Polyporus pinsitus laccase were investigated at pH 4–10. In the case of peroxidase, an apparent bimolecular rate constant (expressed as k _cat/K _m) varied from 1 ×10⁷M⁻¹s⁻¹to 2.6×10⁸M⁻¹s⁻¹ at pH 7.0. The constants for PO oxidation were higher in comparison to PT. pH dependence revealed two or three ionizable groups with pK _a values of 4.9–5.7 and 7.7–9.7 that significantly affected the activity of peroxidase. Single-turnover experiments showed that the limiting step of PT oxidation was reduction of compound II and second-order rate constants were obtained which were consistent with the constants at steady-state conditions. Laccase-catalyzed PT and PO oxidation rates were lower; apparent bimolecular rate constants varied from 1.8×10⁵M⁻¹s⁻¹ to 2.0×10⁷M⁻¹s⁻¹ at pH 5.3. PO constants were higher in comparison to PT, as was the case with peroxidase. The dependence of the apparent bimolecular constants of compound II or copper type 1 reduction, in the case of peroxidase or laccase, respectively, was analyzed in the framework of the Marcus outer-sphere electron-transfer theory. Peroxidase-catalyzed reactions with PT, as well as PO, fitted the same hyperbolic dependence with a maximal oxidation rate of 1.6×10⁸M⁻¹s⁻¹ and a reorganization energy of 0.30 eV. The respective parameters for laccase were 5.0×10⁷M⁻¹s⁻¹ and 0.29 eV. Received: 20 September 1999 / Accepted: 24 February 2000     

Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin

The nanomechanical properties of the coiled-coils of myosin are fundamentally important in understanding muscle assembly and contraction. Force spectra of single molecules of double-headed myosin, single-headed myosin, and coiled-coil tail fragments were acquired with an atomic force microscope and displayed characteristic triphasic force-distance responses to stretch: a rise phase (R) and a plateau phase (P) and an exponential phase (E). The R and P phases arise mainly from the stretching of the coiled-coils, with the hinge region being the main contributor to the rise phase at low force. Only the E phase was analyzable by the worm-like chain model of polymer elasticity. Restrained molecular mechanics simulations on an existing x-ray structure of scallop S2 yielded force spectra with either two or three phases, depending on the mode of stretch. It revealed that coiled-coil chains separate completely near the end of the P phase and the stretching of the unfolded chains gives rise to the E phase. Extensive conformational searching yielded a P phase force near 40 pN that agreed well with the experimental value. We suggest that the flexible and elastic S2 region, particularly the hinge region, may undergo force-induced unfolding and extend reversibly during actomyosin powerstroke.     

白术同源四倍体的诱导和鉴定及其与二倍体过氧化物酶的比较

以白术（Atractylodes macrooephala Koidz.）二倍体组培苗为材料,对其四倍体诱导方法进行研究,共获得45个白术同源四倍体株系,为优良株系的选育提供了材料。此外,还分析比较了其中8个白术四倍体株系与二倍体的过氧化物酶同工酶（POD）的酶谱差异,发现四倍体各株系过氧化物酶同工酶谱比二倍体的均多了Rf0.310的谱带,且总过氧化物酶比活力也发生了很大改变,对探讨白术四倍体优良株系的生理生化机理具有一定的参考价值。     

颧骨颧弓骨折的分类及诊治

颧骨颧弓骨折是最常见的面中部骨折之一,迄今为止,在其分类及诊治的选择上仍然存在一定争议,本文对目前颧骨颧弓骨折的分类及诊治的现状和进展作一综述,以期对临床工作提供参考。