我国D2-43病毒株PrM-E基因的重组SFV的制备及生物学鉴定

 为构建含PrM E基因的重组SFV病毒 ,将含我国登革 2型病毒PrM E基因的SFV表达载体和辅助载体DNA线性化后 ,进行体外转录 .然后将获得的 2种RNA转录物共转染BHK2 1细胞 ,以RT PCR法证明转染后的细胞培养上清中含有重组SFV .进一步将该重组病毒经蛋白酶激活后可使BHK2 1细胞产生细胞病变 ,并且以间接免疫荧光法在感染细胞内可检测到登革 2型病毒所特有的蛋白 .含我国登革 2型病毒PrM E基因的重组SFV的获得 ,为进一步观察该重组病毒的免疫原性奠定了基础 ,从而为登革新型疫苗的研制提供新途径     

登革2型PrM基因的重组病毒对不同型别登革病毒复制的阻断作用

观察登革 2型PrM基因的pSFV重组甲病毒抗该型病毒的作用 ,进一步探讨登革 2型PrM基因的这种重组病毒对其它 3个血清型登革病毒复制的阻断作用 .采用体外转录和电穿孔 ,分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒 .再将激活的重组病毒感染细胞 ,分别用不同型病毒进行攻击 .然后通过免疫荧光法 ,观察对登革病毒复制的阻断作用 .结果表明 ,含登革 2型PrM基因的重组病毒不仅可阻断登革 2型病毒的复制 ,同样具有抑制其他 3个型病毒复制的能力 ,且抗登革 1、4型病毒的复制作用强于抗登革 3型病毒的作用 .用 10 3 TCID50 剂量的登革病毒攻击 ,含反义PrM基因的重组病毒可完全阻断登革 1、3、4型病毒的复制 .但含正义PrM基因的重组病毒对登革 3型病毒的复制不能完全阻断 .为探讨登革病毒防治新途径奠定了基础     

我国登革2/4型病毒株Pr-M-E基因的双表达质粒构建及在真核细胞中的共表达

将我国登革 2、4型病毒分离株PrM E基因通过RT PCR以病毒RNA为模板扩增我国登革 2型 4 3株和 4型B5株的PrM E基因 .并分别克隆至pGEM TEasy载体 ,然后亚克隆至双顺反子表达质粒的两个多克隆位点 ,获得同时含有登革 2型 4 3株和 4型B5株PrM E基因的双顺反子重组表达质粒pIDME2 4 .在用该重组质粒转染的BHK2 1细胞中 ,不但可检测到PrM E基因的转录产物 ,而且采用间接免疫荧光法还可观察到针对登革 2型 4型病毒的特异荧光 .研究结果表明 ,重组的双顺反子表达质粒在真核细胞中可共表达登革两个血清型PrM E基因 ,为双价登革核酸疫苗的研究奠定基础     

登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究

将扩增的登革 2型病毒株PrM基因导入pSFV载体的SP6启动子下游 ,筛选出含该基因正、反向插入的重组质粒DNA。用SpeI酶分别将重组的和辅助的质粒DNA线性化 ,并将其体外转录成 5′末端含帽子结构的RNA。再将这两种RNA共转染BHK细胞。然后将转染的宿主细胞用登革 2型病毒株攻击 ,并分别观察含正、反义PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒效果。通过碱基序列测定 ,筛选出含PrM基因正、反向插入的pSFV PrM重组质粒。并获得了经重组RNA与辅助RNA共转染细胞而产生的重组病毒颗粒。含有反义PrM基因的重组病毒RNA ,在宿主细胞中具有抗登革 2型病毒复制的作用 ,而且强于含正义PrM基因的重组病毒RNA。     

登革3型病毒prM-E基因重组质粒DNA的构建和真核表达

构建登革 3型病毒 prM E基因的真核表达重组质粒 ,并进行体外表达 ,为登革DNA疫苗的研究奠定基础。用RT -PCR法获得 prM -E基因片段 ,然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒DNA转入BHK细胞 ,通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达。结果 ,通过酶切和序列测定证实了构建的重组质粒DNA含序列正确的 prM- E基因。用免疫荧光法检测到转染了重组质粒DNA的BHK细胞的胞浆中有登革 3型病毒特异蛋白的表达。说明含有登革 3型病毒prM -E基因的真核表达重组质粒可以在BHK细胞中表达 ,该结果为观察该重组质粒的免疫原性奠定了基础。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classical swine fever virus , CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在PK-15细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒配基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在PK-15细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。     

登革2型病毒衣壳蛋白在哺乳动物细胞中的表达与鉴定

从构建的重组质粒pLEX—C中高保真PCR获得编码登革2型病毒43株C基／E／（D2C）DNA片段,通过基因重组的方法将其克隆入真核表达载体pcDNA6／V5-His获得了重组真核表达载体pc／D2C。经电穿孔的方法转染BHK21细胞后,分别通过RT—PCR、免疫荧光和western印迹鉴定表达的蛋白。结果重组蛋白在BHK21细胞中获得表达,表达的蛋自主要存在于胞浆中,并具有较好的抗原性,能够被抗登革病毒衣壳蛋白单克隆抗体特异识别。此研究为深入了解登革病毒衣壳蛋白在病毒复制及组装过程中的生物学功能奠定了基础。     

传统DNA疫苗载体与Semliki森林病毒复制子对HIV-1 Pr55gag表达与体液免疫原性的比较性研究

为探索Semliki森林病毒(SFV)衍生的复制型DNA载体可否用于HIV疫苗的候选载体,对该载体与传统DNA疫苗载体对HIV-1Pr55gag的表达与体液免疫原性进行了系统比较研究.将野生型(wtgag)及密码子改造(syngag)的HIV-1 ⅢB gag基因分别克隆于SFV DNA载体及传统DNA疫苗载体[pCDNA3.1(+)],对其Pr55gag细胞内表达水平、Pr55gag病毒样颗粒释放、以及在BALB/c鼠的体液免疫原性进行了比较.在293T、H1299、C2C12和BHK细胞系中,SFV-wtgag可以Rev非依赖方式有效表达Pr55gag,而pC-wtgag转染的细胞不能有效表达Pr55gag,从而不能诱导小鼠产生免疫反应.虽然SFV质粒的细胞转化效率明显低于pCDNA载体,SFV-wtgag和SFV-syngag在细胞内Pr55gag的表达量与pC-syngag相似,而Pr55gag病毒样颗粒的释放明显低于pC-syngag.在肌内注射免疫的小鼠中,低剂量(0.1和1.0μg)的SFV及pCDNA gag表达质粒均未诱导出GAG特异性免疫反应.在高剂量(10,30,100μg)免疫组中,与SFV gag表达质粒相比,pC-syngag可诱导出较高水平的TH1型GAG特异性抗体.SFV-syngag较SFV-wtgag可诱导出高水平的体液免疫反应.结果提示,SFV衍生的复制子单独使用不能在小鼠诱导出优于传统DNA疫苗载体的HIV-1 GAG特异性体液免疫反应,其原因可能与病毒样颗粒的释放有关.密码子改造的gag基因的优势在SFV载体系统中得到了进一步证实.     

A型肉毒毒素受体结合区Hc在重组SFV复制子载体中的表达

为了在哺乳动物细胞中表达A型肉毒毒素Hc抗原, 构建了含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的基于RNA和DNA的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus, SFV)复制子表达载体。RNA和DNA复制子载体转染BHK21细胞后, 经间接免疫荧光、Western印迹和ELISA检测, 结果表明非分泌型和分泌型的Hc抗原在细胞中都得到了有效地表达; 而且复制子表达载体与辅助病毒载体共转染均可制备高滴度的重组病毒颗粒, 该重组病毒颗粒感染细胞后, 也都能表达Hc抗原。以上结果表明, 基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体在细胞中均可有效地表达Hc抗原和制备具有感染能力并能表达Hc抗原的重组病毒颗粒。基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体的构建和含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组病毒颗粒的获得, 为进一步观察SFV复制子疫苗的免疫原性奠定了基础, 从而为A型肉毒毒素新型疫苗的研制提供了新途经。     

登革2型病毒非结构蛋白NS4B及其突变体的真核表达与鉴定

目的：构建登革2型病毒非结构蛋白NS4B及其突变体Δ2K-NS4B基因的真核载体,并观察二者在哺乳动物细胞内的定位情况。方法：从登革2型病毒43株的全长cDNA克隆载体上扩增获得编码NS4B及缺失2K片段的NS4B突变体Δ2K-NS4B的基因;通过基因重组的方法分别将2段基因克隆入真核表达载体pcDNA6/V5-HisA,获得重组真核表达载体pc/D2-NS4B和pc/D2-Δ2K-NS4B;经脂质体法转染BHK-21细胞后,用RT-PCR、间接免疫荧光和Western印迹鉴定表达的蛋白。结果：重组蛋白D2-NS4B和D2-Δ2K-NS4B可在BHK-21细胞中表达,二者均定位于细胞质中,并具有较好的抗原性,能够被抗登革2型病毒NS4B的多克隆抗体特异识别。结论：重组蛋白D2-NS4B和D2-Δ2K-NS4B在哺乳动物细胞胞质中的正确表达,为深入了解NS4B在登革病毒致病过程中的生物学功能奠定了基础。     

登革病毒NS3全基因的扩增与克隆

登革热(ＤＦ)、登革出血热及登革休克综合征(ＤＨＦ/ＤＳＳ)是由登革病毒所致的两种不同临床类型的急性传染病,广泛流行于全球热带及亚热带地区。ＤＨＦ/ＤＳＳ以高热、出血、休克、高病死率为主要特征,近年来其发病率有迅速增加的趋势,已成为严重影响人类健康的公共卫生问题。迄今,ＤＨＦ/ＤＳＳ的发病机制仍不清楚,亦无有效的特异性预防方法[1]。登革病毒属于黄病毒科的黄病毒属,有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个血清型,基因组为单股正链ＲＮＡ,全长约11ｋｂ,编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白。基因组顺序为5′ＣＰｒＭＥＮＳ1ＮＳ2ａＮＳ2ｂＮＳ3Ｎ…     

分子克隆化禽网状内皮组织增生症病毒传染性及其前病毒全基因组序列研究

利用脂质体转染技术,将含有SNV株禽网状内皮组织增生症病毒 （REV）前病毒全基因组cDNA克隆质粒转染鸡胚成纤维细胞（CEF）.用对REV的单克隆抗体和抗REV env-gp90的鼠血清作间接免疫荧光反应,在原始的转染细胞及随后传代的细胞中均显示病毒特异性抗原.而且,在连续传代细胞中的阳性率明显升高.用REV特异性引物对进一步传代后的细胞基因组作PCR,也检测出REV基因组.这些结果均表明所得到的分子克隆化病毒具有传染性,因而也进一步证明所用的质粒克隆包含有具感染性的全病毒基因组.对该全基因组cDNA克隆进行酶切所获得的数个亚克隆进行测序,并将序列进行拼接,完成了REV全基因组序列.REV的这个传染性克隆将有助于进一步研究REV的分子生物学特性.     

狂犬病病毒糖蛋白的杆状病毒表达及其免疫原性研究

构建表达狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)的重组杆状病毒,评价其表达出的SRV9株糖蛋白对小鼠免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆入穿梭质粒Bacmid中,构建重组穿梭质粒Bacmid-G,以此转染Sf9细胞。对病变细胞培养物进行电镜观察,获得正确重组杆状病毒后,通过Western-blot、IFA及小鼠免疫实验鉴定表达产物的免疫反应性及免疫原性。正确构建重组穿梭质粒Bacmid-G;获得表达SRV9株糖蛋白的重组杆状病毒,其表达产物具有良好免疫原性;表达产物接种小鼠可诱导其产生抗狂犬病病毒中和抗体,中和抗体达到保护水平的比例为100%。本实验所获得的重组杆状病毒表达出的SRV9株糖蛋白具有较好的免疫原性,可诱导小鼠产生保护性中和抗体,该实验为进一步开发狂犬病亚单位疫苗奠定了基础。     

串联表达PRRSV M与GP5蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

利用PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的M基因,按正确的读码框与GP5基因串联,成功构建穿梭载体pShuttle-CMV-M-GP5,经PCR、测序鉴定正确。PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,产生重组腺病毒DNA。重组腺病毒DNA经PacⅠ线性化后用脂质体转染HEK-293A细胞,在细胞内包装成完整的腺病毒,通过IFA可以检测到M与GP5串联的重组腺病毒构建成功,可以正确地表达目的蛋白。将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,结果表明可以诱导产生较强的体液免疫应答(ELISA抗体和中和抗体)和细胞免疫应答(淋巴细胞增殖和CTL反应)。证明该重组腺病毒具有较好的免疫原性,为下一步猪体免疫试验奠定了基础。