发菜耐旱相关蛋白NXL-01的基因克隆与表达分析

在发菜耐旱差异蛋白质组学研究中,发现假定蛋白(Hypothetical protein NXL-01)在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加。根据已知氨基酸序列设计简并引物克隆NXL-01基因,长度为327bp(GenBank登录号为HM854288)。生物信息学分析表明,该基因具有较高保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成,是亲水性的膜外蛋白,有5个Ser磷酸化位点,1个Thr磷酸化位点。将NXL-01基因在大肠杆菌中表达,获得预期大小的重组蛋白(12.4kD)。RT-PCR分析表明,NXL-01mRNA在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加,与NXL-01蛋白的表达趋势一致。     

发菜G6PDH基因(GND)克隆及其干旱胁迫下的差异表达分析

由GND编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是戊糖磷酸途径的关键酶。为了解发菜GND分子信息以及对干旱胁迫的响应机制,该研究设计了特异性引物克隆发菜GND全长,进行序列分析、原核表达和MALDITOF-TOF/MS鉴定,并对干旱胁迫下发菜GND的差异表达水平和G6PDH活性进行分析。结果表明:(1)发菜GND全长1 431bp(GenBank登录号为KX553955),与点形念珠藻(73102)的GND核苷酸序列相似性为96%,G6PDH氨基酸相似性为98%;氨基酸序列中第26和27位的Ile疏水性最强,在第302位的Arg亲水性最强,Thr有19个磷酸化位点,Ser有18个磷酸化位点,Tys有5个磷酸化位点,二级结构和三级结构主要由α螺旋、β折叠、β转角和随机卷曲构成。(2)将GND基因进行原核表达,获得47.23kD的外源表达蛋白G6PDH。(3)随干旱胁迫程度加剧,GND在转录水平的表达量和G6PDH活性均逐渐增加。研究结果为进一步探讨干旱胁迫条件下发菜GND表达调控奠定了基础。     

干燥和复吸水条件下发菜Mn-CAT差异表达与基因克隆

运用双向凝胶电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS质谱鉴定和数据库检索,分析发菜锰过氧化氢酶(Mn-CAT)在干燥和复吸水后的差异表达水平,根据Mn-CAT鉴定的已知氨基酸序列设计简并引物克隆该基因,并研究其原核表达.结果表明:干燥发菜复吸水后Mn-CAT表达量明显高于干燥状态下的表达量.使用简并引物克隆获得长度为693 bp的Mn-CAT基因(GenBank登录号为GU549477).将Mn-CAT基因在大肠杆菌中表达,获得1个约26 kD的外源蛋白,经Western blotting验证,该外源蛋白为Mn-CAT.研究结果为进一步研究发菜耐旱的分子机理、探讨发菜对极端干旱环境的适应机制奠定了基础.     

发菜磷酸葡糖胺变位酶(glmM)对干旱胁迫的响应及其基因克隆

glmM编码的磷酸葡糖胺变位酶是肽聚糖合成前体的关键酶。为探究发菜glmM响应干旱胁迫的表达调控机制及明确其分子信息,本研究对干旱胁迫条件下发菜glmM在转录水平的差异表达进行了分析,并对glmM的表达水平、磷酸化修饰、乙酰化修饰和琥珀酰化修饰水平进行了检测,克隆了发菜glmM,进行了序列分析和原核表达。结果表明,干旱胁迫条件下,发菜glmM在转录水平上的表达量先增加后减少,glmM上调表达,glmM的磷酸化修饰水平逐渐增加,乙酰化修饰水平相对稳定,琥珀酰化修饰水平有明显变化。设计特异性引物克隆glmM基因,获得全长1416 bp发菜glmM基因,与肺衣(5183)glmM的核苷酸序列同源性为95%,氨基酸同源性为97%。将glmM在大肠杆菌中表达,获得一个51.45 kD的外源蛋白,MALDI-TOF-TOF/MS分析证明该蛋白为磷酸葡糖胺变位酶。研究结果为深入研究发菜glmM的分子信息、生物学功能及其响应干旱胁迫的分子机制提供帮助。     

吸水和干燥条件下发菜核糖体代谢差异表达基因分析

为解析发菜吸水和干燥条件下的基因差异表达规律以及发菜适应“干 湿”水分节律调控机制,该研究以充分吸水发菜藻体为对照组,干燥状态下的发菜藻体为处理组,采用高通量Illumina HiSeq PE150测序平台结合生物信息学分析方法对发菜吸水和干燥条件下的差异表达基因进行分析。结果显示：(1)发菜吸水和干燥条件下共鉴定到差异表达基因3 383个,其中显著上调和显著下调表达的基因数分别为1 767个和1 616个。(2)GO功能富集分析发现,在吸水和干燥条件下发菜差异表达基因主要富集在蛋白质合成与代谢等相关途径中;KEGG显著性富集分析发现,吸水和干燥条件下发菜有46个差异表达基因被显著富集到核糖体代谢途径,且均为显著上调表达,这些基因可能参与发菜对干旱胁迫的响应。(3)随机挑选6个被显著富集到核糖体代谢途径的基因进行qRT PCR分析发现,其基因相对表达量与转录组测序结果一致。研究表明,发菜在干燥条件下可能通过激活核糖体代谢特定基因表达帮助抗旱相关的蛋白质的合成和正确折叠、并参与渗透调节等重要生理活动进而调控其适应干燥环境条件。     

干旱胁迫条件下发菜cphB差异表达与基因克隆

发菜是一种分布在干早、半干旱荒漠草原地区的陆生固氮蓝藻,对干旱具有极强的适应性。采用qRT-PCR技术,对干旱胁迫条件下发菜cphB的差异表达进行了分析,发现干旱胁迫条件下发菜cphB在转录水平上呈逐渐增加的趋势。根据发菜同源物种设计简并性引物克隆cphB基因,获得长度为864bp的DNA(GenBank登陆号为KX092456)。同源性比较发现发菜cphB基因具有较高的保守性,二级结构预测表明发菜CphB由α螺旋,β折叠和随机卷曲构成。三级结构预测表明CphB具有一个由α螺旋和β折叠组成的5股的结构域和由7个β折叠连成三明治结构的7股的结构域。将cphB基因在大肠杆菌中表达,获得符合预期的外源重组蛋白,CphB亚细胞定位于细胞质中。研究成果为进一步研究干旱胁迫条件下发菜cphB表达调控、藻蓝素的代谢机制及能量代谢机制方面奠定了基础。     

发菜PspA基因克隆及其转基因植物的抗旱性分析

为探讨发菜噬菌体休克蛋白A(PspA)的分子信息和基因功能,本研究通过设计特异引物克隆发菜PspA基因,采用qRT-PCR技术,分析发菜PspA基因在干旱胁迫下的表达模式;构建PspA真核表达载体pCAM35s-GFP-PspA,对PspA进行亚细胞定位和PspA基因拟南芥遗传转化,并对阳性转化拟南芥分别进行Southern和Western杂交验证;对转基因植株进行抗旱实验,结果表明,PspA基因全长为777 bp,干旱胁迫下发菜PspA基因表达量显著增加;PspA定位于细胞膜上,通过花絮浸染法获得稳定遗传的转PspA基因拟南芥。Southern杂交表明,PspA基因已成功导入拟南芥基因组中并以低拷贝形式存在,Western blot进一步证实PspA蛋白在转基因拟南芥中成功表达。在干旱胁迫下,转PspA基因拟南芥生长状态明显好于野生型植株。研究结果为深入探讨发菜PspA基因功能及其在响应干旱胁迫过程中的应答机制奠定了基础。     

干旱胁迫下发菜光合作用相关基因差异表达分析

该研究以不同失水处理的发菜为研究材料,以充分吸水状态的发菜为对照,利用高通量测序技术和qRT PCR技术检测了干旱胁迫下发菜光合作用相关基因差异表达规律,并对光合色素和酶活在干旱胁迫下的变化进行了研究。结果表明：(1)发菜在不同程度干旱胁迫下有113个光合作用相关基因差异表达,其中失水30%、75%和100%的发菜分别有44个、74个和91个光合作用相关基因差异表达。(2)随着干旱胁迫程度的加深藻胆素、叶绿素a和类胡萝卜素含量逐渐降低,Rubisco活性随着干旱胁迫程度的增强先上升后下降,GAPDH活性随着干旱胁迫的增强呈现下降的趋势。研究表明,发菜通过光合作用相关基因的差异表达调控光合作用以适应干旱胁迫。该研究结果对进一步研究发菜干旱胁迫响应机制及其耐旱光合机理奠定了基础。     

发菜固氮基因nifD和nifK克隆及其失水条件下的差异表达

nifD和nifK编码钼铁固氮酶中的钼铁蛋白。为了解发菜nifD和nifK分子信息及对水分胁迫的响应机制,该研究设计了简并性引物克隆发菜nifD和nifK全长,进行原核表达和生物信息学分析,并对不同失水状态下发菜nifD和nifK在转录水平的差异表达和固氮酶活性的变化进行分析。结果表明,发菜nifD和nifK全长分别为1 443 bp和1 536 bp (登陆号为分别为KU886164和KU886165);将nifD和nifK在大肠杆菌中表达,分别获得一个约57 kD和58 kD的外源蛋白;生物信息学分析表明,nifD和nifK核苷酸序列和推译的氨基酸序列均与点形念珠藻(Nostoc punctiforme PCC 73102)高度一致性;nifD和nifK的二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和随机卷曲。此外,随着藻体含水量的逐渐降低,发菜nifD和nifK在转录水平上的表达量逐渐增加,但固氮酶活性呈现先增加后下降的趋势。研究结果为深入全面研究发菜固氮酶基因结构及其响应水分胁迫的固氮机理及氮代谢途径提供了基础。     

miR156调控菊花逆境响应与开花的表达特性研究

为明确菊花miR156及其靶基因CmSPL13在逆境胁迫应答和生长发育中的表达特性,该研究以菊花‘神马’为材料,采用高保真PCR技术扩增MiR156启动子序列,并分析该序列特性;通过激素(茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯、生长素类似物NAA)和逆境胁迫(干旱、盐)处理,分析菊花miR156及其靶基因CmSPL13对激素和逆境胁迫的响应表达特征;并分析蔗糖处理下miR156表达特性与开花时间的关系,为miR156参与菊花生长发育与逆境响应的分子机制研究奠定基础。结果表明：(1)克隆获得了MiR156启动子1 584 bp,该启动子序列包含激素(茉莉酸、水杨酸和生长素)应答、厌氧和干旱诱导等逆境胁迫以及光响应等顺式作用元件。(2)茉莉酸甲酯处理下,miR156的表达水平在0～3 h显著上调,3 h后逐渐下降,呈现出先上升后下降的趋势,而其靶基因CmSPL13的表达量呈先下降后上升的趋势,在12 h达到峰值;水杨酸甲酯和生长素NAA处理下,miR156的表达在3 h显著下调,而后逐渐升高,在6～12 h时达到峰值,而后又逐渐下降,但CmSPL13的表达具有与之相反的趋势;PEG处理下,miR156的表...     

逆境条件下小麦种子活力与种子萌发相关酶活性及其基因表达的关系

分析不同基因型小麦品种逆境萌发过程中种子萌发相关酶活性及基因表达差异,明确在逆境条件下,种子活力与种子萌发相关酶活性及基因表达量的关系.通过标准发芽试验和逆境(冷浸、人工老化、干旱胁迫)发芽试验,测定4个小麦品种种子活力、萌发过程中可溶性总糖和可溶性蛋白含量、α-淀粉酶活性、半胱氨酸蛋白酶活性及相关基因表达量.结果表明:干旱、人工老化和冷浸胁迫3种逆境对种子活力都有一定影响.不同萌发条件下,可溶性总糖含量呈现先小幅度升高后小幅度降低再迅速升高的趋势;而可溶性蛋白含量随着萌发时间的延长呈现逐渐下降的趋势.α-淀粉酶活性整体呈现逐渐升高的趋势,但在冷浸胁迫处理后,豫农949和轮选061的α-淀粉酶活性在萌发60 h后出现下降.半胱氨酸蛋白酶活性整体呈先降低后升高的趋势,但在干旱胁迫条件下,豫农949、豫麦49-198和轮选061的半胱氨酸蛋白酶活性呈现先升高后降低再升高的趋势.不同逆境萌发条件下,α-AMY(α-淀粉酶基因)表达量整体呈先上升后下降的趋势.冷浸胁迫处理后,轮选061的α-AMY表达量高于对照,在其他逆境萌发条件下,4个品种的α-AMY表达量均低于对照;人工老化处理后,长4738的CP(半胱氨酸蛋白酶基因)表达量与对照差异不显著,在其他逆境萌发条件下,4个品种的CP表达量均高于对照.种子萌发期间,不同萌发条件下α-淀粉酶和半胱氨酸蛋白酶活性与其基因表达并没有直接关系,α-淀粉酶活性与可溶性总糖含量达到显著正相关,半胱氨酸蛋白酶活性与可溶性蛋白含量的相关性不显著.在标准发芽条件下,α-淀粉酶活性与活力指数呈显著正相关,而在逆境萌发过程中,其相关性不显著.冷浸胁迫处理后,半胱氨酸蛋白酶活性与活力指数呈显著正相关,但在标准发芽、干旱胁迫、人工老化处理后,其相关性不显著.     

Effect of Temperature Water Content and Light Intensity on Nitrogenase Activity of Nostoc flagelliforme

The optimal temperature for the nitrogenase activity in the terrestrial cyanobacterium N. flagelliforme was 21–28℃; the optimal water content in thallus was 1000--1500%; the light saturation was between 150–200 J·m-2·s-1. The thallus of N. flagelliforme is extremely sensitive to higher temperature in wet. Long-term exposure of wetted thallus to high temperature at 45℃ causes rapid declination of its nitr0genase activity to zero. Under dry condition, N. flagelliforme is extremely resistant to extensive desiccation and heat exposure. Dry thalli exposed to 55℃, 5 hours daily for 21 days, show no marked change in its nitrogenase activity. The thalli preincubated in wet condition for 4–5 days, are highly sensitive against desication. However, repeated drying/wetting cycles induce a slow and gradual increase of its nitrogenase activity and improve the resistance of its nitrogenase activity against desiccation. High concentrated NaC1 salt solution (0.17–0.43 mol/L) depletes nitrogenase activity of the thalli quickly. Above result shows that N. flagelliforme is not able to resist against salt. The physiological characteristics of nitrogen fixation of cyanobacterium N. flagelliforme may be eonsidered as a result of drought adaptation of the terrestrial ecological condition aad the drying westting cycle is perhaps a necessary factor to maintain its growth.     

Molecular cloning of maltooligosyltrehalose trehalohydrolase gene from Nostoc flagelliforme and trehalose-related response to stresses

A genomic DNA fragment encoding a putative maltooligosyltrehalose trehalohydrolase (NfMTH) for trehalose biosynthesis was cloned by the degenerate primer- PCR from cyanobacterium Nostoc flagelliforme. The ORF of NfMTH is 1,848 bp in length and encodes 615 amino acid residues, constituting a 70 kDa protein. The deduced amino acid sequence of NfMTH contains 4 regions highly conserved for MTHs. By expression of NfMTH in E. coli, the function of this protein was demonstrated, where the recombinant protein catalyzed the hydrolysis of maltooligosyl trehalose to trehalose. The expressions of MTH and maltooligosyltrehalose synthase in the filaments of N. flagelliforme were upregulated significantly under dehydration stress, NaCl stress, and high temperature-drought stress. The accumulations of both trehalose and sucrose in the filaments of N. flagelliforme were also improved significantly under the above stresses. Furthermore, trehalose accumulated in smaller quantities than sucrose did when under NaCl stress, but accumulated in higher quantities than sucrose did when under temperature-drought stress, indicating that both trehalose and sucrose were involved in N. flagelliforme adapted to stresses and different strategies conducted in response to various stress conditions.     

Global regulation of reactive oxygen species scavenging genes in alfalfa root and shoot under gradual drought stress and recovery

Reactive oxygen species (ROS) production and scavenging in plants under drought stress have been studied intensively in recent years. Here we report a global analysis of gene expression for the major ROS generating and scavenging proteins in alfalfa root and shoot under gradual drought stress followed by one-day recovery. Data from two alfalfa varieties, one drought tolerant and one drought sensitive, were compared and no qualitative differences in ROS gene regulation between the two were found. Conserved, tissue-specific patterns of gene expression in response to drought were observed for several ROS-scavenging gene families, including ascorbate peroxidase, monodehydroascorbate reductase, and peroxiredoxin. In addition, differential gene expression within families was observed. Genes for the ROS-generating enzyme, NADPH oxidase were generally induced under drought, while those for glycolate oxidase were repressed. Among the ROS-scavenging protein genes, Ferritin, Cu/Zn superoxide dismutase (SOD), and the majority of the glutathione peroxidase family members were induced under drought in both roots and shoots of both alfalfa varieties. In contrast, Fe-SOD, CC-type glutaredoxins, and thoiredoxins were downregulated.     

长春花Crlea基因的克隆及原核表达初步分析

晚期胚胎丰富（Late Embryogenesis Abundant, LEA）蛋白是植物在干旱胁迫下响应并被描述为具有潜在的抗旱功能的一类重要的抗旱蛋白。通过建立干旱胁迫下长春花（Catharanthus roseus）的cDNA文库并进行测序筛选分析,首次分离得到Crlea（Crlea for Catharanthus roseus late embryogenesis abundant）全长基因。该基因具有492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸,其中偏性氨基酸含量占总蛋白的55.9%。同源性分析表明该假定蛋白与胡萝卜（Daucus carota）LEA DC3 的同源性达69%。亲水性分析表明具有极强的亲水性。为进一步验证CrLEA蛋白的功能,构建了Crlea基因的原核表达载体并在大肠杆菌中对其表达进行了分析。结果表明,原核载体成功的表达了CrLEA蛋白,亲水性实验及热稳定性实验表明CrLEA蛋白具有极强的亲水性和热稳定性。     

沙鞭PvDREB基因克隆与表达特异性分析

基于沙鞭的三代转录组数据,该研究利用PCR技术克隆DREB基因,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式以及在20%PEG-6000模拟干旱胁迫处理下的表达特征,以探讨干旱胁迫下沙鞭DREB转录因子的功能和作用,为揭示PvDREB基因响应沙鞭的耐旱分子机制奠定基础。结果表明：(1)成功克隆获得一个沙鞭DREB基因,命名为PvDREB;PvDREB基因编码区长度831 bp、编码276个氨基酸,含有典型的AP2转录因子保守结构域;PvDREB蛋白是亲水性蛋白,不具有信号肽结构,存在跨膜结构和可能的糖基化及磷酸化位点。(2)系统进化分析显示,PvDREB基因与毛竹的DREB亲缘关系较近。(3)亚细胞定位预测表明,PvDREB蛋白定位于线粒体和细胞核中。(4)qRT-PCR显示,沙鞭根、茎和叶中PvDREB均可诱导表达但差异较大,且在茎中表达量最高,叶中次之,根中最低,具有明显的组织特异性;20%PEG-6000模拟干旱下,PvDREB基因在叶中的表达量随干旱胁迫时间增加而增加,12 h时达到最高,之后逐渐下降。研究推测,沙鞭PvDREB基因受干旱胁迫诱导表达,且...     

小麦铝胁迫基因TaAIP的克隆表达分析及亚细胞定位

以小麦抗逆相关蛋白TaMAPK2作为诱饵,利用酵母双杂交系统进行筛库,获得互作蛋白TaAIP。氨基酸序列分析发现TaAIP具有wali保守区,并且与一些物种的铝诱导蛋白相似。实时荧光定量PCR分析显示,TaAIP基因受到铝、干旱以及高盐胁迫上调表达。半定量RT-PCR结果表明,TaAIP在小麦茎中表达,在根部、叶片以及花中没有表达。亚细胞定位实验发现,TaAIP定位在细胞膜上。这些结果为深入分析TaAIP的抗逆性作用机理打下基础。