荧光定量PCR检测干旱胁迫下长春花Crlea基因的相对表达

首次从长春花中克隆了Crlea（Crlea for Catharanthus roseus late embryogenesis abundant）的全长基因,采用荧光定量PCR方法对干旱胁迫下长春花叶片和根部Crlea基因的表达模式进行监测,结果表明,在0.5～8 h的胁迫时间中,叶片和根部的Crlea基因表现出相似的积累模式。长春花Crlea基因的表达随着胁迫时间的延长而表达增强。在叶片中,在6 h和8 h的干旱处理后,Crlea基因表达显著提高,分别是未处理材料的9.984和20.431倍。在根部, 在8 h的处理后,Crlea基因的表达量显著提高（2.831倍于对照)。初步结果表明Crlea基因的表达没有组织特异性,并且为干旱胁迫正调控。     

长春花金属硫蛋白基因原核表达载体的构建及表达研究

将从长春花中克隆的金属硫蛋白基因（GenBank登录号：DQ016341）构建到高效原核表达载体pGEX-6P-1,并命名为pGEX-6P-1-CrMT,并对GST-CrMT融合蛋白的表达进行诱导和条件优化。对不同的诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,随诱导时间增长GST-CrMT融合蛋白表达量提高,22℃,24 h和37℃,240 min均能诱导GST-CrMT融合蛋白的最大量表达,在0.8 mmol·L^-1 IPTG浓度下可以有效诱导GST-CrMT融合蛋白的表达。     

白桦下胚轴再生系统的建立

本文对白桦下胚轴的再生系统作了研究。讨论了不同的基本培养基、激素组成、培养条件及外植体的生理年龄在不同阶段产生的效应。通过诱导、分化和生根阶段, 得到了再生植株, 提出了最适的基本培养基、激素组成、培养条件及下胚轴外植体的生理年龄, 为白桦的遗传转化奠定了基础。     

长春花Crlea基因的克隆及原核表达初步分析

晚期胚胎丰富（Late Embryogenesis Abundant, LEA）蛋白是植物在干旱胁迫下响应并被描述为具有潜在的抗旱功能的一类重要的抗旱蛋白。通过建立干旱胁迫下长春花（Catharanthus roseus）的cDNA文库并进行测序筛选分析,首次分离得到Crlea（Crlea for Catharanthus roseus late embryogenesis abundant）全长基因。该基因具有492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸,其中偏性氨基酸含量占总蛋白的55.9%。同源性分析表明该假定蛋白与胡萝卜（Daucus carota）LEA DC3 的同源性达69%。亲水性分析表明具有极强的亲水性。为进一步验证CrLEA蛋白的功能,构建了Crlea基因的原核表达载体并在大肠杆菌中对其表达进行了分析。结果表明,原核载体成功的表达了CrLEA蛋白,亲水性实验及热稳定性实验表明CrLEA蛋白具有极强的亲水性和热稳定性。     

以叶盘为外植体的白桦的再生

从不同的激素组成(BA, K T, 2, 4~D, NAA, GA₃)、基本培养基(MS, WP)、外植体放置的方向性进行了实验, 建立了以白桦叶盘为外植体的再生系统。当叶盘向轴面朝下放置在培养基上时, 三周后, 从叶盘边缘生出不定芽。不定芽的诱导率为64%, 平均每片叶盘可生出6 个不定芽。叶盘再生系统的建立为白桦的遗传转化提供了前提。     

根癌农杆菌介导GUS基因对白桦转化的研究

本文报道了根癌农杆菌介导GUS基因转化白桦叶盘的研究方法,对转化过程中各种因素进行了全面探讨,结果表明:白桦叶盘对卡那霉素的敏感实验,得出最适筛选浓度为50mg/l;对头孢霉素和羧苄青霉素的抑菌实验,最适抑菌浓度为500mg/l;100μMAS的加入可将抗性不定芽的诱导率提高3倍;3~4d的预培是最适合叶盘转化的时间;10~20min是最适合叶盘浸染的时间;3~4d的共培养对于叶盘转化比较合理。在上述最适合的转化条件下,农杆菌介导的GUS基因对白桦叶盘的转化获得了抗性再生植株,转化率为2.8%。