农业其它

构建了第一个不致癌的土壤杆菌(Agrobaoterium)转化载体,共整合到Ti质粒的T一DNA.区域如胭脂碱质粒pTiC58Tra-c的整个T一DNA内,只是边缘序列和胭脂碱     

甘露碱合成酶基因启动子调控的萤光素酶基因在转化烟草中的表达

利用我们自己分离的甘露碱含成酶基因启动子与萤光素酶结构基因、胭脂碱合成酶基因’3末端结构相拼构成一融合基因,并在带有此融合基因的中间载体PBZ7610插入Ti质粒T区的tmr基因,构成中间载体pBZ7621。利用改建的Ti质粒载体PGV3850,将萤光素酶融合基因引入了烟草植株,结果表明,萤光素酶融合基因在转化烟草中能表达。中间载体pBZ7610还带有PstⅠ,HindⅢ,XbaⅠ等多个单一的酶切位点,外源基因极易插入。利用中间载体pBZ7621,还可研究启动子在高等植物不同发育阶段中的功能特征。     

植物组织中冠瘦碱合成酶活性检测的一种简便有效方法

由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 感染引起的植物冠4瘤(crown gall)细胞除 具激素自养性生长特性外,还具有一类特殊的 基因产物,即冠瘦碱(opines)"'。常见的冠瘦碱 主要有章鱼碱(octopine）和胭脂碱(nopaline) 等。催化章鱼碱合成的酶为章鱼碱合成酶( octopine sy nthase),或叫Lysopine脱氢酶[D- （＋）一lysopine dehydrogenase, 简称LpDH] o 催化胭脂碱合成的酶为胭脂碱合成酶(nopaline sy nthase),或称胭脂碱脱氢酶(nopaline dehydrogenase, 简称NpDH)。即在NADH存在条 件下,LpDH催化丙酮酸与精氨酸的缩合反应, 形成章鱼碱;NpDH催化。一酮戊二酸和精氨酸 的缩合反应,形成胭脂碱。     

植物组织中冠瘿碱合成酶活性检测的一种简便有效方法

由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染引起的植物冠瘿瘤(crown gall)细胞除具激素自养性生长特性外,还具有一类特殊的基因产物,即冠瘿碱(opines)~[3]。常见的冠瘿碱主要有章鱼碱(octopine)和胭脂碱(nopaline)等。催化章鱼碱合成的酶为章鱼碱合成酶(oct-opine synthase),或叫Lysopine脱氢酶[D-(+)-lysopine dehydrogenase,简称LpDH]。催化胭脂碱合成的酶为胭脂碱合成酶(nopaline     

双抗(抗病毒及抗虫)植物表达载体的构建及番茄的转化鉴定

将抗病毒的ＣＭＶ－ｃｐ 基因和抗虫的Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ 基因依次插入到植物表达载体ｐＥ３ 的ＨｉｎｄⅢ和ＫｐｎⅠ位点,通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定,然后以土壤农杆菌ＧＶ３１１－ＳＥ介导转化番茄,胭脂碱检测,染色体ＤＮＡ 的点杂交及ＰＣＲ扩增证明ＣＭＶ－ｃｐ 基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ 基因已同时导入转化再生的番茄植株。ＲＮＡ 点杂交证明ＣＭＶ－ｃｐ 基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ 基因已在转基因番茄植株中同时获得表达。     

Ti质粒基因在单子叶植物石蒜和金针菜中的表达

本文报道了用胭脂碱型致瘤农杆菌感染单子叶植物石蒜和金针菜的实验结果。石蒜和金针菜的花茎幼嫩部位被致瘤农杆菌A_(208)感染后,一个月内形成小瘤。纸电泳结果表明,所有瘤组织都含有胭脂碱,证明石蒜和金针菜的细胞可被转化并表达nos基因;本文讨论了致瘤农杆菌转化单子叶植物的范围和筛选方法。     

双抗（抗病毒及抗虫）植物表达载体的构建及番茄的化鉴定

将抗病毒的ＣＭＶ－ｃｐ基因和抗虫的Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因依次插入到植物表达载体ＰＥ３的ＨｉｎｄⅢ和ＫｐｎⅠ位点,通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定,然后以土壤农杆菌ＧＶ３１１－ＳＥ介导转化番茄,胭脂碱检测,染色体ＤＮＡ的点杂交及ＰＣＲ扩增证明ＣＭＶ－ｃｐ基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因已同时导入转化再生的番茄植株。ＲＮＡ点杂交证明ＣＭＶ－ｃｐ基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因已在转基因番茄植株中同时获得表达。     

植物基因工程研究的潜在受体——甘蓝

本文报道了3个致瘤农杆菌的菌株对4个甘蓝品种的致瘤作用。并从甘蓝的畸胎瘤的幼苗叶片在无激素的MS培养基上直接分化出幼苗和A 208菌株诱导的报春甘蓝瘤组织上幼苗叶片诱导出愈伤组织并分化出大量不定芽,再分化的幼苗和不定芽均含有胭脂碱。同时观察了畸胎瘤上分化的幼苗长成植株、开花结实和整个生长期间胭脂碱含量的变化。说明了甘蓝是研究基因工程的潜在的受体材料。     

Ti质粒T区tms基因的分离及其对高等植物分化的影响

根癌农杆菌Ti质粒的T区DNA带有致瘤基因,其基因1和基因2编码生长素吲哚乙酸生物合成途径中的两个酶。以pGV 354(pBR322质粒中插有Ti质粒C 58 T区DNA的HindⅢ15—HindⅢ22大片段)重组质粒出发,我们分离了基因1和基因2,并构建了带有卡那霉素抗性基因的重组质粒pBZ 692,通过基因载体pGV 3850,我们将基因1和基因2引入了高等植物。结果证明基因1和基因2能促使烟草、向日葵、土豆等转化组织分化长根,转化的根在MS_0培养基上能脱分化形成愈伤组织并自主生长,在转化的组织中有转化标记胭脂碱的存在。     

致瘤农杆菌对荔枝的致瘤及T-DNA转移

用致瘤农杆菌的四个菌系C58、B3/73、T37和ACH5对木本植物荔枝进行致瘤试验,诱导出冠瘿瘤,在无激素的MS培养基上从瘤组织中分化出愈伤组织。生化测定表明,其瘤组织的愈伤组织中均含有胭脂碱基因。证明Ti质粒上的T-DNA已转移到荔枝细胞基因组中。     

外源甜蛋白thaumatin II基因转入烟草的研究

利用土壤农杆菌系统,将高甜度的外源甜蛋白thaumatin II基因转入烟草细胞,并得到大量转基因植株及其后代。经分子杂交分析确证thaumatin II基因已整合到烟草植株的基因组中,并在转录水平检测到表达。标记基因胭脂碱合成酶(NOS)基因及新霉素磷酸转移酶(NPT II)基因也在转基因植株中正常表达。     

遗传工程植物中对基因表达的控制

把有用的特征转移到植物体中,一直是植物遗传工程中的一个主要的目标。而目前正在进行的一些最热门的工作是鉴定和转移控制基因表达的 DNA 序列。人们现在已经能够通过遗传工程技术把基因“开关”引入到植物中,基因“开关”可以随意打开或关闭。由英国 Durham 大学的 C.H.Shaw 等所作的一篇报告中提出了“第一个在染色体上表达的植物启动子的功能图谱”。所描述的这个启动子能够控制胭脂碱合成酶基因的表达。西德     

葡萄根癌土壤杆菌诱导的葡萄、毛叶曼陀罗冠瘿瘤的离体培养和植株再生

生化Ⅲ型葡萄根癌土壤杆菌MI3-2、BS33-6等菌株含有致瘤的Ti质粒。用章鱼碱菌株MI3-2、MI14-1、MS32-1、MI22-1及胭脂碱菌株BS33-6、BS33-7、从葡萄试管苗的茎诱导出冠瘿瘤。脱菌的葡萄冠瘿组织能在无外源植物激素供给的MS培养基继代生长,并合成章鱼碱或胭脂碱。章鱼碱冠瘿组织疏松、白色或淡黄色;胭脂碱冠瘿组织硬脆,深绿色,表面有许多小突起。两种冠瘿组织都未能诱导再生植株。 胭脂碱菌株BS33-6能诱导毛叶曼陀罗产生畸胎瘤,这种无菌畸胎瘤组织在无植物激素的培养基内,培养1个月能分化出植株。     

植物激素和抗生素调节的转基因火炬松愈伤组织的生长和分化

包含质粒载体pBI121的农杆菌菌株LBA4404被用于转化火炬松的成熟合子胚。质粒载体pBI121含有胭脂碱合成酶基因的启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因（npt Ⅱ)和花椰菜花叶病毒的35S启动子驱动的GUS基因。器官发生的转基因愈伤组织和转基因的再生植株已经获得,并经GUS组织化学染色、聚合酶链式反应和Southern杂交分析证实。植物激素（BA/IBA）和抗生素对转基因愈伤组织的生长和分化的影响被研究。500mg/L羧苄青霉素和2mg/LBA、0.5mg/L IBA的组合导致转基因愈伤组织的生长增加54.2%,分化增加45.7%。500mg/L Claforan和2mg/L BA、0.5mg/L IBA的组合导致转基因愈伤组织的生长增加40.8%,分化增加38.7%。高浓度的植物激素和抗生素降低了转基因愈伤组织的生长和分化。实验结果有助于建立一个高效的农杆菌介导的火炬松遗传转化系统,也有助于未来针叶树的遗传转化研究。     

GUS基因—植物基因工程中重要的报道基因

研究高等植物基因表达,特别是调控机理,常常需将基因或调控片段从原来的背景下分离出来,采用与报道基因融合的方法,通过基因的体外转移进行精确的分析。至今为止,在高等植物基因表达的研究中,至少用过6种报道基因:A、β一半乳糖苷酶(β-galatosidase)基因;B、氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicolacetyl-transferase,CAT)基因;C、新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,NPTⅡ)基因;D、胭脂碱合成酶(nopaline synthase)基因;E、章鱼碱合成酶(octopine synthase)基因;F、荧光素酶     

胭脂碱合成酶基因在龙葵基因组中的转移

利用致瘤农杆菌的三个菌株B3/73、M3/73和pTi214感染龙葵植株诱发了畸胎瘤。由B3/73菌株诱导出的瘤组织产生的幼苗和幼茎能够在无激素的培养基上直接分化出愈伤组织和小植株;由M3/73和pTi214菌株诱导出的瘤组织块需要在含有激素5mg/1 LAA,0.5mg/l2,4-D,0.5mg/l KT的MS培养基中经过短期培养后,使其产生愈伤组织,再转移到没有激素的培养基中培养,才能分化出小植株。测定表明这些小植株都含有胭脂碱。从这些小植株诱导出的愈伤组织在固体培养基中经过一年多时间十几次继代培养,和通过二十多次液体悬浮培养,建立了较稳定的细胞系,在继代培养的愈伤组织和细胞株系中都测出了胭脂碱,说明胭脂碱合成酶基因能够整合到龙葵基因组中并可以正常表达。     

新城疫病毒融合蛋白在转基因水稻叶片中的表达及其免疫原性

利用转基因植物作为生物反应器表达抗原蛋白具有广阔的应用前景。以新城疫病毒融合蛋白（NDVF）基因1.7kb全长编码区序列为外源基因与组成型表达的玉米泛素蛋白基因（Ubi）启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因（nos）终止子组成嵌合基因,构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的转化载体pUNDV,经根癌农杆菌介导的遗传转化方法将由Ubi动子驱动的NDVF嵌合基因导入水稻细胞中,经潮霉素抗性筛选,共再生获得了6个独立的转基因株系。PCR分析结果表明NDVF基因已整合到水稻基因组中。ELISA和Western blot分析结果证实NDVF蛋白在部分转基因水稻叶片组织中获得表达,其中植株F5叶片组织中具有较高的表达水平。将F5叶片可溶性总蛋白皮下注射免疫BALB／c小鼠,结果表明能够诱导小鼠产生一定水平的NDVF蛋白特异抗体。     

高效马铃薯遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入

本研究选用了三个马铃薯(Solanum Iuberosum L.)栽培品种“85T-14-3”、“86-2”及“Favorita”的块茎、微型薯和试管薯为起始材料,应用根癌农杆菌 Ti 质粒系统成功地建立了一种方法简单、速度快和频率高的遗传转化体系。其中试管薯薄片的转化速度最快,经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)共培养后,薄片在100mg/L 卡那霉素的分化培养上,2—3周就可产生出抗性小芽,这些小芽进一步仲长后可在50—100mg/L 卡那霉素的无激素MS 培养基上生根。从共培养到转化植株的获得只需6—7周。微型薯和试管薯的转化频率较高,最高可达67.5%。大多数抗性植株均能检测到胭脂碱合成酶或 GUS 基因的表达。把带有甜蛋白基因和胭脂碱合成酶标记基因的Ti质粒导入马铃薯,获得大量转化植株。叶片抗性检测和 nopaline 检测可推断外源甜蛋白基因已进入马铃薯基因组。     

向植物导入外源DNA方法的研究与发展

为满足人类对粮食和其它农产品的多种需求,利用现代生物技术手段培育高产,稳产、优质、抗病虫,抗逆植物新品种是农业生物技术研究的主要内容之一。对植物进行遗传改造的首要环节是,研究和开发向植物细胞导入外源基因的技术。近年来,向植物细胞导入外源DNA的方法在实践中不断创新发展。目前主要采用的方法有以下几种: 一、根癌土壤杆菌介导的外源基因转移 整合型的根癌土壤杆菌Ti质粒是最常用的一种载体。研究最多的是octopine(章鱼碱)型和nopaline(胭脂碱)型Ti质粒。在Ti质粒上有一段T-区,T-DNA能从该质粒转移到敏感植物的核基因组中。T-DNA边界有25bp正向重复序列可能接受某种酶识别切割,进而形成环状中间体。此外,Ti质粒上还有—个约50kb的Virulence区(简称Vir区),约有十几个基因。Vir区不在T-DNA内。Vir产物是一