小鼠beta-防御素2真核表达载体的构建及表达

构建小鼠heta-防御素2(murie beta-defensin 2,mBD2)的真核表达载体pcDNA-mBD2,并观察其在真核细胞中的表达.从小鼠肝组织中提取mRNA通过逆转录聚合酶链反应扩增得到mBD2基因,定向克隆至真核表达栽体pcDNA3.1(+)获得pcDNA-mBD2;经酶切和测序鉴定构建正确,应用脂质体法转染siha细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内mBD2的表达.结果显示,构建了小鼠mBD2的真核表达载体,转染siha细胞培养并采用G418稳定筛选后,获得稳定转染细胞,收集并裂解转染细胞,蛋白免疫印迹法检测到转染细胞内mBD2的表达.成功构建了真核表达裁体pcDNA-mBD2,为研究mBD2在宫颈癌发生发展过程中的作用及作用机制奠定基础.     

水稻EPSP合酶cDNA克隆、序列分析及其拷贝数测定

根据本室分离的水稻EPSP合酶基因的基因组序列设计一对引物,利用RT-PCR方法首次从水稻(Oryza sativa L. subsp. indica)叶片的RNA中扩增获得了水稻编码EPSP合酶的全长为1 585 bp的cDNA片段,它含有一个完整的开放读码框,编码511个氨基酸,包括444个氨基酸组成的成熟肽序列以及N端的67个氨基酸组成的叶绿体转运肽序列.成熟肽氨基酸序列对比表明,除真菌来源的EPSP合酶变异较大外,其他来源的EPSP合酶同源性较高,均在51%以上.而叶绿体转运肽氨基酸序列同源性较低.Southern杂交表明水稻EPSP合酶基因在水稻基因组中以单拷贝形式存在.RT-PCR分析表明,水稻EPSP合酶基因在根、未成熟种子和叶片中均有转录表达,在叶片中表达量最高.     

The first intron of rice EPSP synthase enhances expression of foreign gene

The first intron (EPI) of rice 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase gene was isolated by PCR from one clone with genomic EPSP synthase gene. Sequence analysis showed that the first intron is 704 bp in length with 36.2% G+C content. To investigate its effect on expression of foreign gene, we inserted the first intron between CaMV35S promoter and β-glucuronidase (GUS) gene. The transient expression results showed that GUS could be expressed effectively with EPI. The GUS activity in transgenic tobacco shows that the EPI can greatly enhance the expression level of β-glucuronidase (P < 0.01) compared with transgenic tobacco without the first intron, and 3-to 6-fold increase in GUS activity in some transgenic tobaccos. Northern blot indicated the first intron was spliced from GUS pre-mRNA, and the steady-state mRNA levels of GUS with EPI in transgenic tobaccos were higher than that in transgenic tobacco without EPI, which suggested that the first intron of EPSP was a non-translated intron.     

新疆12种黄芩属植物叶表皮微形态结构的研究

应用光学显微镜和扫描电镜技术对新疆12种黄芩属植物叶片上的微形态特征进行观察。结果表明:该属植物叶的上表皮细胞形状及垂周壁式样有多种形式;而下表皮细胞形状均为不规则形,垂周壁式样均为深波形,不具分类学意义,但叶片两面分布的气孔器,在不同种间气孔大小、气孔密度、气孔指数、气孔外拱盖内缘等方面都存在着显著差异;其表皮角质层纹饰和表皮毛的微形态也各有不同;大多数植物叶片表面具腺点,其大小、分布及疏密程度也有不同。植物叶表皮上的这些微形态特征,可为探讨本属种间的分类学及亲缘关系提供一定的佐证。     

病毒诱导的PVX cp转基因沉默及其DNA甲基化

利用PCR方法获得了马铃薯X病毒(PVX)外壳蛋白(CP)基因(cp),并将其构建到植物表达载体中,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。Northern杂交及Run on实验表明有3株转基因烟草发生了转录后基因沉默。发生沉默的cp基因的甲基化分析结果表明,发生转录后基因沉默的cp基因发生了不同程度的甲基化,说明DNA甲基化并没有完全抑制cp基因的转录。利用PVX病毒对外壳蛋白正常表达的转基因烟草进行接毒,Northern杂交检测结果表明,病毒诱导cp发生了基因沉默。进一步的Run on结果表明,转基因烟草中cp基因在沉默前后转录速率并没有发生变化,说明病毒诱导的沉默是一种转录后沉默。对cp基因沉默前后的甲基化分析表明,病毒的侵染导致了cp基因甲基化程度的增加。     

干扰livin基因对胃癌细胞SGC7901增殖的影响

根据我国西北部胃癌发病率高的特点,通过RNA干扰技术,抑制胃癌细胞SGC7901的livin基因表达后,采用RT-PCR和细胞生长曲线法,分析胃癌细胞SGC7901的恶性生长、增殖特性.发现成功沉默livin基因后,SGC7901的生长速度明显减慢、恶性表型减轻.抑制livin基因的表达可以作为治疗胃癌的潜在靶点.     

小鼠beta防御素2原核表达与抗菌作用的初步研究

构建小鼠β-防御素-2( mouse beta defensins 2,mBD2)原核表达质粒pET32/mBD2,进行蛋白诱导表达及纯化,测定并纯化蛋白的抗菌活性.旨在为选一步研究其生物学特性奠定基础.通过腹腔注射脂多糖(lipopoly-saccharide,LPS)建立小鼠急性时相反应,采用RT-PCR方法扩增mBD2成熟肽,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pET-32a(+)载体,构建的重组质粒.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3),采用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达.通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白.将融合蛋白采用肠激酶酶切、洗脱并用滤纸片法测定目的蛋白的抗菌活性.成功构建了原核表达质粒pET32a(+)/mBD2,并转化工程菌BL21( DE3).在0.25 mmol/L IPTG、30℃诱导4h条件下获得的融合蛋白.采用抑菌试验证实蛋白具有一定的抑制革兰阳性菌及阴性菌生长的作用.本研究成功构建了pET32/mBD2原核表达质粒,得到了在大肠杆菌中稳定表达mBD2蛋白.     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因烟草

建立了一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因植物的方法。通过体外重组构建了双T-DNA双元载体pDLBRBbarm。载体中,选择标记nptⅡ基因和另一代表外源基因的bar基因分别位于2个独立的T-DNA。利用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.),在获得的转化植株中,同时整合有nptⅡ基因和bar基因的频率为59．2％。对4个同时整合有nptⅡ和bar基因植株自交获得的T1代株系进行检测分析,发现在3个T1代株系2个T-DNA可以发生分离,其中约19．5％的转基因T1代植株中只存在bar基因而不带选择标记nptⅡ。这一结果说明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记的转基因植物。研究还利用位于2个不同载体上的nptⅡ基因与bar基因通过农杆菌介导共转化烟草,获得共转化植株的频率为20．0％～47．4％,低于使用双T-DNA转化的共转化频率。     

水稻EPSP合酶cDNA克隆、序列分析及其拷贝数测定

根据本室分离的水稻EPSP合酶基因的基因组序列设计一对引物 ,利用RT_PCR方法首次从水稻 (Oryzasati vaL .subsp .indica)叶片的RNA中扩增获得了水稻编码EPSP合酶的全长为 15 85bp的cDNA片段 ,它含有一个完整的开放读码框 ,编码 5 11个氨基酸 ,包括 44 4个氨基酸组成的成熟肽序列以及N端的 6 7个氨基酸组成的叶绿体转运肽序列。成熟肽氨基酸序列对比表明 ,除真菌来源的EPSP合酶变异较大外 ,其他来源的EPSP合酶同源性较高 ,均在 5 1%以上。而叶绿体转运肽氨基酸序列同源性较低。Southern杂交表明水稻EPSP合酶基因在水稻基因组中以单拷贝形式存在。RT_PCR分析表明 ,水稻EPSP合酶基因在根、未成熟种子和叶片中均有转录表达 ,在叶片中表达量最高