重组人胰岛新生相关蛋白的表达、纯化及免疫活性研究

摘要 目的：对胰岛新生相关蛋白（Islet neogenesis associated protein ,INGAP）进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法： INGAP基因片段插入表达载体pET22b(+),在E.coli BL21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8M尿素溶解,Heparin Agrose亲合柱层析为第一步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定INGAP蛋白的浓度,将纯化的INGAP蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗INGAP血清,采用免疫双扩、ELISA及Western Blot分析INGAP的免疫活性。结果INGAP以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经Heparin Agrose亲合柱层析和凝胶过滤层析二步组合纯化目的蛋白,经HPLC测定目的蛋白的最终纯度为98.81%,表达及纯化的INGAP具有良好的免疫活性。     

重组A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原的制备及初步免疫保护作用研究

诱导表达重组工程菌Pbv/cpa408后,将表达菌体超声破碎,上清经80%饱和硫酸铵一次沉淀,经透析,上凝胶过滤层析柱进行分离纯化,薄层凝胶扫描结果显示,纯化的蛋白纯度达95%以上;用纯化蛋白免疫昆明小鼠,以1.0MLD100腹腔进行攻击,被免疫小鼠获得了100%的保护。     

丝状支原体丝状亚种SC型脂蛋白Q N末端基因的表达、纯化与抗原性分析

为了表达丝状支原体丝状亚种SC型(MmmSC)中国分离株HVRIⅩ脂蛋白Q(LppQ)N末端基因,将该基因经PCR扩增后克隆至原核表达载体pET32a中,经酶切、PCR、测序证实获得了重组表达质粒,转化Escherichia coliBL21(DE3)菌,经IPTG诱导后获得可溶性融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的53.7%,用Ni-NTAHis.Bind纯化试剂盒纯化后,蛋白纯度达95%以上。表达蛋白经Western blot检测其抗原活性,结果表明纯化蛋白可与CBPP标准阳性血清发生强烈的反应,而与阴性血清不发生反应。     

铜绿假单胞菌LexA蛋白的纯化及免疫活性分析

目的：对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的LexA蛋白进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法： lexA基因片段插入表达载体pET32a(+),在E.coli BL21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8M尿素溶解,镍离子亲合柱层析为第一步纯化,Superdex 75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定蛋白的浓度,将纯化的LexA蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗LexA血清,采用免疫双扩、ELISA及Western Blot分析LexA的免疫活性。结果：LexA以包涵体形式表达,经镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析二步组合纯化目的蛋白,经HPLC测定目的蛋白的最终纯度为98.97%,表达及纯化的LexA具有良好的免疫活性。     

大肠杆菌表达Trx-rPA融合蛋白的复性纯化

大肠杆菌高密度发酵以包涵体形式表达融合蛋白Trx-rPA,表达量22%。包涵体蛋白洗涤后经金属螯合层析纯化,纯度达80%以上。经胱氨酸衍生,以脉冲加样形式复性,复性率可高达30%。经ETI-Sepharose纯化,复性的融合蛋白生物活性可达3.5×105IU/mgPr.。融合蛋白可被rEK酶切释放rPA,酶切效率达85%以上。酶切液经IDA-Sepharose和SP-Sepharose层析纯化,rPA纯度达98%以上,生物活性50万IU/mgPr.。1L发酵液经分离、复性及纯化后,可得高纯度rPA300mg以上。     

重组沙蚕激酶的诱导表达和分离纯化

将已构建好的表达载体pGEX-4T-2SAK 转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合的沙蚕激酶蛋白,通过GST树脂亲和吸附和凝血酶酶切及冷冻干燥等步骤进行分离纯化,用SDS-PAGE分析要重组的目的蛋白及纯化后的蛋白.纯化后的沙蚕激酶经纤维平板法测定具有溶栓活性.冷冻干燥品经SDS-PAGE分析表明达到电泳纯.     

鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

利用PCR技术,以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因(VP1),以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后,克隆至表达载体pET-30a(+) 中,从而构建了原核表达质粒pET30-VP1.将pET30-VP1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,可见约45kDa的目的蛋白获得表达.该蛋白经亲和层析纯化后,免疫6-8w的雌性Balb/c鼠,三次免疫后,采血分离血清,制得抗VP1的多克隆血清.以纯化的VP1为包被抗原,用ELISA方法检测,制备的血清效价达12800×以上.以Western blot 检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性.VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础.     

Scytovirin在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:获得Scytovirin(SVN)蛋白及其多克隆抗体.方法:按照NCBI上公布的SVN基因序列设计合成引物,合成SVN基因,构建pET32c-SVN原核表达重组质粒,经限制性酶切分析、DNA序列测定插入片段正确;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达;用离子交换层析法及金属亲合层析法纯化蛋白,采用Tris-Tricine系统分析;以经过纯化的蛋白为抗原免疫白兔,制备SVN多克隆抗体.结果:对表达产物进行了分离纯化,SVN纯度达到91%;用纯化的样品制备了多克隆抗体,抗血清效价为1∶102 400.结论:SVN在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并制备了其多克隆抗体,为进一步深入研究SVN提供了材料.     

罗非鱼无乳链球菌Sip基因的克隆、表达及免疫原性分析

表面免疫原性蛋白(Surface Immunogenic Protein,Sip)是B群链球菌(Group B Streptococcus,GBS)的一种表面蛋白,在GBS多种血清型的菌株中均有表达。研究从实验室分离到的罗非鱼无乳链球菌广东株的基因组DNA中扩增出Sip基因,构建原核表达载体pColdII-Sip,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株。经诱导表达、SDS-PAGE电泳检测显示重组蛋白主要以可溶形式表达。重组蛋白用亲和层析的方法纯化,蛋白纯度达98%。纯化后的重组蛋白免疫罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)以分析其免疫原性。受免鱼免疫14d后进行人工攻毒试验,免疫组的相对保护率为70%—87%。酶联免疫吸附试验(Elisa)显示受免鱼对重组蛋白产生了较好的免疫应答,免疫剂量为3μg/g和5μg/g时受免鱼血清抗体滴度可达1:128000。研究结果显示重组蛋白Sip具有较强的免疫原性和保护作用,Sip基因可作为罗非鱼链球菌基因工程亚单位疫苗候选基因。     

卵泡刺激素受体短肽的表达及纯化

目的:表达人卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)N端第18-34氨基酸片段.方法:将FSHR N端第18-34氨基酸片段克隆p-pGEX4T-1中,构建成重组质粒pGEX4T-1-FSHRN(18-34位氨基酸).将该重组质粒转化E.coli BL21后,IPTG诱导其表达,经亲和层析进行分离纯化,western blot鉴定.结果:克隆成功,并表达FSHRN端第18-34氨基酸片段,所表达的融合蛋白中60%为可溶性蛋白.结论:成功克隆、表达、纯化了人FSHRN端第18-34氨基酸片段,为后续动物免疫试验提供抗原.