T7噬菌体展示人肝癌cDNA文库筛选人CD8~+T淋巴细胞特异结合分子

目的:利用噬菌体表面展示技术从人肝癌T7 cDNA文库中筛选出能与人CD8~+T淋巴细胞特异结合的蛋白分子。方法:以人CD8~+T淋巴细胞为筛选靶标,对人肝癌T7 cDNA噬菌体肽库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"生物淘选与富集,ELISA鉴定特异结合的噬菌体单克隆;对获得的阳性克隆裂解液进行PCR扩增及DNA测序,然后进行生物信息学分析,确定所编码的结合蛋白。结果:经过4轮筛选,结合人CD8~+T淋巴细胞的噬菌体克隆得到富集,通过测序与同源性比对分析获得17个特异性结合的多肽序列;生物信息学分析发现阳性噬菌体克隆的同源蛋白中,可能与肝癌免疫逃逸相关的分子有Unc-51样自噬活化激酶1(ULK1)、一般受体磷酸肌醇相关支架蛋白1(GRASP)、中间α球蛋白抑制因子H1(ITIH1)、富含亮氨酸重复8家族成员D(LRRC8D)和CD164等。结论:从人肝癌T7 cDNA噬菌体肽库中筛选获得了能与人CD8~+T淋巴细胞特异结合的分子,为阐明人肝癌发生发展过程中肿瘤免疫逃逸相关机制奠定了基础。     

亲和层析法用于噬菌体抗体库的筛选

本研究报道一种基于固定化金属亲和层析(IMAC)的噬菌体抗体库液相筛选方法。将纯化的带有His标签的抗原与噬菌体抗体库混合,噬菌体抗体与抗原充分结合后再加入亲和介质,使噬菌体抗体抗原复合物通过His标签与介质结合,然后通过充分洗涤去除非特异性噬菌体抗体,最后将特异性噬菌体抗体洗脱下来,感染TG1,进行下一轮筛选。整个筛选过程中抗原与抗体的结合在液相中完成,不仅消除了固相介质对抗原表位的影响,也更有利于噬菌体抗体与抗原的充分作用。将此方法应用于HEV NE2蛋白特异性人源噬菌体抗体的筛选,抗原竞争ELISA,阳性血清阻断,可溶性单链抗体表达检测及测序结果表明,最终获得2个特异性人源抗体。     

抗人白细胞介素15中和抗体识别抗原表位的噬菌体肽库筛选与鉴定

目的:用噬菌体呈现随机七肽库筛选能与抗人白细胞介素15(h IL-15)中和抗体特异性结合的模拟抗原表位肽,并初步鉴定其免疫原性。方法:以抗h IL-15中和抗体为靶分子,用生物淘洗法从噬菌体呈现线性七肽库中筛选与之结合的噬菌体克隆,用噬菌体ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;化学合成筛选得到的多肽,并与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联免疫BALB/c小鼠,检测其免疫原性。结果:经过3轮体外筛选后随机挑取50个阳性噬菌体克隆,ELISA检测结果显示其中15个克隆与抗h IL-15抗体有较强的结合能力,DNA测序结果得到的结构相似群为MTPFWQK、MSPFNQK、MIPYWQK和MIPFHQK;竞争性ELISA结果显示4个序列均能与IL-15竞争性地结合抗IL-15单抗;小鼠免疫实验结果显示4组多肽均能诱导IL-15特异性免疫反应。结论:筛选得到能与抗h IL-15中和抗体特异性结合,且具有免疫原性的模拟抗原7肽序列,为进一步开发h IL-15相关的多肽疫苗提供了依据。     

新型人血清白蛋白特异结合肽ML的筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术筛选和鉴定新型人血清白蛋白(HSA)特异结合7肽,分析与垂体腺苷酸环化酶激活肽27(PACAP27)构成的融合多肽ML-PACAP27与HSA的亲和结合力,以确定筛选的7肽(ML1和ML2)在与其他药物多肽或蛋白融合状态下仍具有较高的HSA结合活力。利用噬菌体展示7肽库,经四轮筛选、筛选克隆的DNA测序、酶联免疫吸附技术分析(ELISA)初步鉴定筛选克隆与HSA的亲和作用,并利用等离子共振技术(SPR)定量测定合成的ML-PACAP27融合多肽与人血清白蛋白的亲和力常数。实验结果表明:经筛选获得2个与人血清白蛋白特异性结合的7肽序列,其氨基酸序列分别为:ML1:LKSCKPL和ML2:SLKSHAL;ELISA分析结果显示,含有ML1和ML2的噬菌体均可亲和结合HSA,而且ML2的亲和结合作用高于ML1;SPR分析结果显示,ML1-PACAP27和ML2-PACAP27与HSA的解离常数(KD)分别为:8.1×10-6mol/L和3.7×10-6mol/L,ML1-PACAP27与HSA的结合力高于ML1-PACAP27。筛选和鉴定了两个可与HSA特异性结合的7肽序列,该7肽序列可用于特异偶联HSA的长效分子药物的重组融合表达或设计,可为延长分子药物的半衰期及新型药物研发提供新工具。     

利用噬菌体肽库筛选与HIV-1p24抗原结合的多肽

通过噬菌体展示技术筛选出与HIV-1p24抗原结合的多肽,为用多肽辅助p24抗原检测提供实验基础.以重组p24抗原为靶蛋白,对噬菌体随机七肽库进行三轮筛选,用EUSA鉴定第三轮筛选到的噬菌体克隆与p24重组抗原的结合能力,再对噬菌体克隆进行测序分析,同时研究了ELISA中噬菌体加入量及多种封闭剂对噬菌体特异性结合能力的...     

基于人HMGB1-B box的抑制性小肽筛选及其抗炎功能分析

目的从噬菌体构象型7肽库中筛选人HMGB1-Bbox的抑制性小肽。方法以重组人HMGB1-Bbox为靶分子对噬菌体构象型7肽库进行6轮亲和筛选,获得Bbox结合的克隆,并经ELISA验证。选取亲和力高的克隆进行DNA测序,并推导出呈现的多肽序列,通过IL-6 ELISA检测噬菌体呈现的小肽对人HMGB1-B box致炎功能的抑制作用。结果经过6轮亲和筛选,噬菌体的回收率增加,阳性克隆得到富集。挑选15个结合力强的克隆进行测序,推导出2个多肽序列。所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制人HMGB1-B box刺激THP-1细胞产生炎症因子的能力。结论获得了噬菌体呈现的能够抑制人HMGB1-B box的两个小肽。     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

趋化因子受体 CCR5 亲合短肽的筛选

趋化因子受体 5 (CCR5) 是 HIV-1 与宿主细胞结合的辅助因子之一,其功能缺失或被 CCR5 拮抗剂封闭则会阻止 HIV-1 感染细胞 . 为得到与 CCR5 特异结合的肽类拮抗剂,采用噬菌体展示技术,以稳定表达 CCR5 的 CHO 细胞 (CHO/CCR5) 作为靶标,通过噬菌体随机 12 肽库筛选与 CCR5 特异结合的多肽;经过四轮筛选后,挑选 20 个阳性噬菌体克隆进行测序,从中得到 11 个含有 AFDWTFVPSLIL 序列的小分子肽 . 含该序列的噬菌体能与抗人 CCR5 单抗 (2D7) 竞争性结合 CCR5 ,且合成肽 AFDWTFVPSLIL 对趋化因子 RANTES 与 CHO/CCR5 的结合具有明显的抑制作用,初步证明该小肽与 CCR5 具有特异性结合作用 .     

噬菌体肽库筛选抗人B7-H4中和抗体的模拟抗原表位及其免疫原性鉴定

目的:用噬菌体呈现随机12肽库筛选能与抗人B7-H4(h B7-H4)中和抗体特异性结合的模拟抗原表位肽,并用其免疫小鼠检测其免疫原性。方法:以抗h B7-H4中和抗体为靶分子,用体外生物淘洗法从噬菌体呈现随机12肽库中筛选与之结合的噬菌体克隆,用竞争性细胞ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;化学合成候选多肽,并与钥孔血蓝蛋白或破伤风毒素偶联鉴定多肽的特异性;进一步用融合蛋白免疫小鼠检测其免疫原性和抗血清的补体依赖的细胞杀伤活性(CDC)。结果:经过3轮体外筛选后随机挑取50个阳性噬菌体克隆,其中20个克隆与抗h B7-H4抗体有较强的结合能力,DNA测序得到6组结构相似的肽序列;竞争性ELISA结果显示1号肽噬菌体能与细胞表面的h B7-H4竞争性地结合抗h B7-H4单抗;点杂交结果显示1号肽能特异性结合抗h B7-H4单抗;小鼠免疫实验结果显示1号肽融合蛋白能诱导高滴度的抗h B7-H4抗血清,并且抗血清具有补体依赖的细胞杀伤活性。结论:筛选得到能与抗h B7-H4中和抗体特异性结合的12肽模拟抗原表位序列并且具有免疫原性,为进一步开发h B7-H4相关的多肽疫苗提供了实验依据。     

紫癜性肾炎特异性结合肽的筛选与鉴定

目的:利用体内噬菌体展示技术筛选并鉴定紫癜性肾炎肾组织特异性结合肽。方法:构建大鼠紫癜性肾炎模型。尾静脉注射噬菌体展示环七肽库,筛选与紫癜性肾炎肾组织特异性结合的噬菌体,经过3轮体内筛选后,提取阳性单克隆噬菌体,并进行DNA测序。利用ELISA方法鉴定单克隆噬菌体对紫癜性肾炎的结合。通过化学合成的方法合成筛选获得的多肽,以流式细胞检测其与肾细胞的结合能力。同时,以合成的多肽体内封闭,检测噬菌体与合成多肽竞争结合紫癜性肾炎肾组织的能力。结果:成功筛选出于大鼠紫癜性肾炎肾组织结合的阳性噬菌体。在随机挑选的43个单克隆噬菌斑中,挑选了其中16个亲和力高的噬菌体,测序后获得了紫癜性肾炎的结合肽CQGPWKLTC。流式结果表明筛选的多肽能够与肾细胞特异性结合。获得的阳性噬菌体能够与紫癜性肾炎肾组织特异性结合,并且与体外合成的多肽具有竞争结合能力。结论:利用体内噬菌体展示技术筛选了与紫癜性肾炎肾组织特异性结合的肽CQGPWKLTC。