细菌DNA的一种大量提取方法

本文介绍了一种大量提取细菌DNA的方法。该法是用60℃裂解菌体,以氯仿-苯酚去除蛋白,用Rnase去除RNA,用1倍体积95%乙醇沉淀DNA,省略了异丙醇沉淀步骤。而且该方法操作方便,对仪器要求不高。该法改进结果是:可稳定地得到50—60%的DNA回收率。可用于革兰氏阴性和阳性细菌的DNA提取。有些菌株用Marmur法和Zaslott法提取,DNA回收率在10%以下,采用本法仍能得到50%的回收率。每次提取的DNA量在毫克数量级。特别适合用于Tm法测定DNA G+C mol%含量所需DNA样品的制备。     

临床等级质粒DNA的实验室制备

在实验室有效获得100 mg临床试验等级的质粒DNA.摇床发酵3个批次,每批次4 L培养液,产生大约160 g的细菌沉淀物.碱裂解菌体,气浮法结合离心分离浮杂沉淀.裂解液经0.45/0.22 μm囊式过滤器过滤.然后采用阴离子色谱介质富集质粒,异丙醇沉淀.重新溶解沉淀后采用100 kD切向流超滤处理,获得100 mg临床试验等级质粒DNA.体外、体内转染试验对质粒表达效果进行了鉴定.结果表明,纯化的质粒DNA几乎检测不到内毒素、RNA和蛋白质,A260/A280比值在1.82～1.86范围内.纯化的质粒DNA能够满足动物临床试验.     

福尔马林保存的动物标本基因组DNA的提取方法

从在福尔马林长期保存的动物标本中提取基因组DNA用于分子生物学研究一直是一个未得到彻底解决的难题。本文提出了一种从浸泡在福尔马林的大仓鼠肝脏和日本鳗鲡肌肉标本中提取基因组DNA的新方法。取浸泡于福尔马林中的大仓鼠肝脏或日本鳗2鲡肌肉适量,用PBS溶液冲洗,放在灭菌的吸水纸上将其揩干,于超净工作台内用无菌剪刀将材料剪成50mg的小块,放入PBS液浸泡12－24h;然后转入70％的乙醇中处理12－24h。依次换入下列梯度酒精中处理：80％乙醇,2h,重复一次;90％乙醇,2h,重复一次;95％乙醇,2h,重复一次;100％乙醇,1h,重复一次。然后将材料放入1／2倍的PBS液中浸泡12h。其间更换一次溶液。提取方法参考Sambroock等人（1989）,加蛋白K瓣量按标准量（100μg/mlL),在50－56℃温浴3－6h处理过程中,不断轻摇混匀,视消化效果可以重复加入标准量的1／2倍蛋白酶K进行消化,直至将材料完全消化为止;酚氯仿抽提最后一次的上清液移入透析袋中透析;沉淀DNA时,在－20℃下20min效果为宜。该方法主要特点在于对标本进行预处理,在保证不使DNA进一步了解的前提下,首先去除标本中所含的福尔马林溶液的成分,然后利用改进的酚氯仿抽提法提取该类标本的基因组DNA,再进一步用透析法纯化DNA。研究结果表明,采用该方法提取和纯化被试标本基因组DNA能较好地应用于RAPD,微卫星位点的PCR扩增、Suthern和斑点杂交。     

不同方式保存的蜘蛛基因组DNA提取方法的探索

基因组DNA的提取是在分子水平上进行研究的基础,提取的DNA的纯度、浓度及结构的完整性是进行基因工程各项研究的前提条件.本文用SDS法、CTAB法和饱和Nac1法等3种方法分别对75%乙醇浸泡、无水乙醇浸泡、-20℃冷冻及新鲜蜘蛛标本基因组DNA进行提取,并进行比较.实验结果表明:使用SDS法提取-20℃冷冻保藏的蜘蛛标本基因组DNA,可以达到分子生物学研究的要求.     

一种从琼脂糖凝胶中同步回收DNA和琼脂糖的方法

介绍一种从琼脂糖凝胶同步回收DNA和琼脂糖的方法。利用0.25 mol/L异硫氰酸胍溶液(p H 8.0)溶解含有目的 DNA片段的的凝胶条,胶条溶解后,静置冰上10 min再加入预冷的异丙醇,琼脂糖呈颗粒状析出,通过离心即可初步分离DNA和琼脂糖。上清液用异丙醇沉淀回收DNA片段,利用50%PEG溶液沉淀琼脂糖。分别对0.2 kb、1 kb和10 kb长度的DNA片段进行回收,回收率分别为19.44%、36.40%、13.49%,回收的DNA纯度高,电泳条带清晰。琼脂糖均回收率为62.52%,回收琼脂糖脱水后的状态为白色颗粒。该方法切实可行,回收成本低廉,回收的DNA和琼脂糖可用于后续实验。     

一种适用范围广的总RNA提取方法

介绍一种RNA提取方法,该方法以SDS、氯仿和Tris苯酚为主要提取试剂,以LiCl和乙醇为RNA沉淀试剂。分别以柽柳(木本植物)、星星草(草本植物)、天牛（昆虫）、酿酒酵母和白腐菌（真菌）为RNA提取材料,用该方法成功地提取出了它们的总RNA。获得的RNA条带清晰,A₂₆₀/A₂₈₀ 在1.8以上。通过对LiCl和乙醇沉淀RNA的效果分析表明,该方法可在10 min内完全沉淀RNA,同时也可以同时获得纯度较高的DNA。提取的RNA质量可满足cDNA文库构建,基因芯片探针标定和RT-PCR等对RNA质量要求较高的分子生物学操作,说明这是一种应用范围广的RNA提取方法。     

不同保存方式下蝗虫组织DNA的提取及RAPD分析

为了开展蝗虫分子系统学研究,分别对冷冻、乙醇浸泡(100%、乙醇、70％乙醇)和干制蝗虫标本用饱和NaCl法进行了基因组DNA的提取,并用随机引物进行扩增,结果表明：70％乙醇固定的标本和部分干标本提取的总DNA得率较低,在琼脂糖凝胶电泳检测中大音琏分有明显降解,导致PCR扩增中信息缺失,甚至无扩增条带;而保存完好的干标本、-20℃冷冻标本和100%,乙醇浸泡标本提取的总DNA带型整齐,无拖尾,PCR扩增结果的稳定性好,成为蝗虫分子系统学研究中首选的三种保存方式。     

碱裂解法提取质粒DNA的研究

对质粒DNA及其结构、形态和功能进行了综述 ,介绍了碱裂解法提取质粒DNA的基本步骤 ,并对其提取过程中的注意事项进行了剖析 ,分析比较了不同提取方法的优点     

人类肠道菌群DNA提取影响因素的研究

目的研究提取人类粪便中细菌基因组DNA的影响因素。方法采用溶菌酶和十二烷基磺酸钠(SDS)+石英砂+酚-氯仿抽提法提取粪便标本中细菌DNA,用PCR扩增细菌16SrDNA。比较不同粪便量,不同放置时间,不同放置温度下的粪便细菌DNA浓度及纯度改变;用Chao index评测高通量测序的结果。结果采用20mg粪便量提取出的细菌DNA的浓度最高;常温下放置3h后,提取的细菌DNA的浓度开始下降;在-20℃放置12h后,细菌DNA的浓度开始下降;-70℃放置48h后细菌DNA的浓度开始下降;样品纯度均在1.8以上;Chao index曲线趋于平缓表明测序数据量足够大。结论提取肠道细菌基因组DNA时,粪便标本取样量以20mg为宜,常温下粪便标本放置不超过2h,本研究所使用的方法所提取的DNA浓度可以达到高通量测序的样本要求。     

大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化

目的:简化操作流程,缩短提取时间,降低试验对操作者的危害。方法:该方法去除酚、氯仿等有害试剂,采用LiCl沉淀去除质粒制备物中小片段核酸(包括DNA和RNA);工程菌生长至对数期时通过加入氯霉素后不仅方便质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除,而且可使质粒的拷贝数进一步增加,提高质粒DNA产量的目的。结果:实验改进方法所提取的质粒DNA产量高于常规方法,达到20μg/mL。结论:改进方法提取的质粒DNA,其下游的内切酶消化,PCR、重组质粒鉴定、转化大肠杆菌等实验的结果和重复性都令人满意,完全可用于一般的分子生物学研究。     

S1核酸酶作用与微环DNA分子的克隆策略

米曲霉来源的S1 核酸酶具有降解单链DNA或RNA的作用。在适当的条件下 ,该酶能将不同的环形DNA分子从超螺旋转变成开环和线形结构 ,对质粒pUC19的实验证明 ,S1 核酸酶的这种转变作用与加入的酶量呈正相关。在 2 5 μL总反应体积中 ,按 10 0ngDNA加入 5u至 17u的S1 核酸酶 ,能获得较高比例的线形DNA。由于微环DNA分子太小 ,单酶切位点的出现率较低 ,很难用常规方式进行克隆 ,以S1 核酸酶进行线形化是微环DNA克隆的途径。pC3是已知最小的真核生物线粒体DNA类质粒 (5 37bp) ,经S1 核酸酶线形化后 ,成功地克隆到pMD18 T载体上。     

SOX6 基因3''UTR 区野生型和突变型重组质粒的构建与鉴定

目的:构建含单核苷酸多态性(SNP)位点rs1065024的SOX6基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体,并用生物信息学软件预测与rs1065024位点区域相结合的mi RNA,为进一步研究此SNP位点的功能及mi RNA与SOX6基因3'UTR区之间的关系奠定基础。方法:提取人全血基因组DNA,以基因组DNA为模板,通过PCR扩增含SNP位点在内的SOX6基因3'UTR片段,经过胶回收纯化后,将回收的目的片段插入双荧光素酶报告基因载体p MIR-REPORT中,再经DH5a转化扩增,挑单克隆进行菌落PCR并进行质粒提取,对质粒进行双酶切鉴定,最后进行DNA测序鉴定。针对SNP进行定点突变,构建出野生型和突变型重组质粒,并用生物信息学软件预测出与SNP位点相结合的mi RNA。结果:经单菌落质粒测序验证显示带有T碱基的SOX6基因3'UTR重组质粒p MIR-REPORT-3'UTR-T构建成功;经定点突变,成功将p MIR-REPORT-3'UTR-T质粒转变为p MIR-REPORT-3'UTR-C,经比对未引入任何其他突变;生物信息学预测显示,rs1065024位点位于mi R-190b、mi R-190a-5p、mi R-451b、mi R-4791与SOX6基因3'UTR的结合区域,其多态的改变可以影响mi RNA与m RNA的结合效率。结论:本研究成功构建了含SNP位点rs1065024的p MIR-REPORT-SOX6-3'UTR野生型和突变型重组质粒,为今后SOX6基因3'UTR的SNP位点的功能及mi RNA与SOX6基因3'UTR区之间的关系研究奠定基础。     

猕猴桃模板DNA的提取及RAPD-PCR最佳反应体系的建立

以改良CTAB法从猕猴桃叶片中制备模板DNA ,优化了PCR热循环参数 ,建立了RAPD PCR扩增的最佳反应体系。实验结果表明 ,CTAB提取液中EDTA组分的浓度对模板提取影响很大 ,其最适浓度为 80mmol/L ;用异丙醇沉淀后不经乙醇洗涤纯化的DNA不会影响扩增效果。PCR热循环参数为 :94℃预变性 5min ;94℃变性 1min ,37℃退火 1min ,72℃延伸 2min ,循环 4 0次 ;最后在 72℃延伸 6min。     

一种大规模筛选单克隆及提取质粒的改进方法

利用α-互补(X-gal IPTG)从cDNA库中筛选特异克隆,以此去除含有未插入片段和插入片段小的克隆。运用展库的方法,通过辅助噬菌体对库中多个载体的切割,将载体以质粒的形式转化到大肠杆菌中;同时对质粒DNA碱裂解提取方法做了改进,建立了一种简单实用的大量提取质粒DNA的方法。该方法利用特定的蛋白质吸附膜吸附提取过程中的蛋白质,从而去除了使用酚-氯仿抽提蛋白质的复杂过程,减少了质粒DNA的损失,是一次性获得大规模质粒DNA的有效方法。获取的质粒DNA样品在纯度和浓度上都可以满足测序、PCR及Southern杂交等分子生物学实验的要求。     

质粒的发现与认识过程

质粒的发现是20世纪生命科学史上的重大事件。对质粒的研究深化了对细菌的认识,并为基因工程奠定了理论基础。主要介绍质粒的发现和认识过程,从质粒的发现、研究和概念的演进3个方面作了介绍,突出介绍20世纪40-60年代生物学家对质粒的发现、研究和认识过程。着重介绍美国生物学家乔治·莱德伯格等人的发现和对质粒的认识过程。     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

920805通过酚抽提法从服硫氛酸中纯化质粒〔英〕/Fishe-r,J .A.…了Anal.Bioehem一1991,194(2)一309~315【译自DBA,1991,10(15),91-08441〕 该方法利用自动核营酸提取设备。基本操作是于pH4.5时用酚从IM的脏氰酸中进行抽提,这样能从水相中有效地去除染色体DNA,而超螺旋的质粒DNA仍留在水相中。51核酸酶消化表明,去除的染色体DNA已经变性,因而可溶于有机相。整套方法包括:用溶菌酶、RNA酶A和蛋白酶K连续预处理细菌细胞;消化后的溶液用酚/氯仿十水混合物抽提二次,再用氯仿抽提一次。通过异丙醇沉淀收集纯化的质粒。这样提纯的质粒中…     

淡水育珠蚌外套膜提取总RNA的改良方法

通过对Trizol法加以改进,提取淡水珍珠蚌外套膜组织中的总RNA。经预处理后,在异丙醇沉淀RNA时加入高浓度的盐溶液,用75%的酒精2次洗涤RNA。用紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取的RNA。结果表明,改良法获得的总RNA完整、纯度高,改良Trizol法是一种从淡水育珠蚌外套膜组织中提取总RNA的高效、便捷、可靠的方法。     

营养条件对pcDNA3\|HBS质粒DNA生产的影响

为了考查营养条件对质粒DNA的生产影响,采用不同的培养基培养含pcDNA33-HBS质粒的大肠杆菌JM109。实验结果表明：碳源、氮源对质粒DNA产量有明显的影响。葡萄糖是质粒合成过程中较佳的碳源,蛋白胨是较佳的氮源。在M9P培养基中,选择合适的硫酸铵浓度对质粒DNA的生产有一定的作用。由于Gly,Asp,Glu能提供合成核苷酸的氮源,在M9G培养基中添加12g/L的Asp,1.0g/L的Glu和0.4g/L的Gly后,经20h培养,质粒产量可达25mg/L。外源核苷也影响质粒DNA的产量,通过添加0.4g/L胞苷与胸苷的混合物(摩尔比为1∶1)到M9P培养基中,质粒DNA的产量可达35mg/L。     

S1核酸酶作用与微环DNA分子的克隆策略

米曲霉来源的S1核酸酶具有降解单链DNA或RNA的作用。在适当的条件下, 该酶能将不同的环形DNA分子从超螺旋转变成开环和线形结构,对质粒Puc19的实验证明, S₁核酸酶的这种转变作用与加入的酶量呈正相关。在25μL总反应体积中,按100ng DNA加入5u至17u的S1核酸酶,能获得较高比例的线形DNA。由于微环DNA分子太小,单酶切位点的出现率较低,很难用常规方式进行克隆,以S₁核酸酶进行线形化是微环DNA克隆的途径。pC3是已知最小的真核生物线粒体DNA类质粒（537bp）,经S₁核酸酶线形化后,成功地克隆到pMD18-T载体上。     

昆虫病毒重组质粒的快速提取

质粒的提取与纯化是基因工程的重要内容。我们用昆虫杆状病毒BsNPV DNA的Bam HI片段与质粒pBR322重组得到重组体pBSa18和pBSb36。用LB摇床培养。 质粒pBR322 DNA用Gonzalls等(1980)的常规法提取。重组质粒的提取是离心40ml培养液收获细胞,加pH7.8 4×TEA缓冲液50ml,GSE(甘油50％,SDS 5％,EDTA0.1M)18ml,70℃保温10分钟,-20℃冷冻过夜,次日在4℃离心12 000r/min15分钟,取上清直接进行制备性琼脂糖凝胶电