临床等级质粒DNA的实验室制备

在实验室有效获得100 mg临床试验等级的质粒DNA.摇床发酵3个批次,每批次4 L培养液,产生大约160 g的细菌沉淀物.碱裂解菌体,气浮法结合离心分离浮杂沉淀.裂解液经0.45/0.22 μm囊式过滤器过滤.然后采用阴离子色谱介质富集质粒,异丙醇沉淀.重新溶解沉淀后采用100 kD切向流超滤处理,获得100 mg临床试验等级质粒DNA.体外、体内转染试验对质粒表达效果进行了鉴定.结果表明,纯化的质粒DNA几乎检测不到内毒素、RNA和蛋白质,A260/A280比值在1.82～1.86范围内.纯化的质粒DNA能够满足动物临床试验.     

siRNA干扰绵羊胚胎成纤维细胞Lig4基因增加同源重组载体重连修复效率

在动物细胞中,抑制非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)修复途径,可以提高同源重组(Homologous recombination, HR)修复基因组双链断裂(Double-strand brakes, DSBs)的发生概率。为了提高绵羊胚胎成纤维细胞的HR效率,针对NHEJ修复途径中的关键因子Lig4(DNA ligase 4)基因,本文设计合成4个具有靶向性的siRNA(Small interfering RNA)。绵羊胚胎成纤维细胞经电转染导入siRNA,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting检测,筛选出有效抑制Lig4基因表达的2个siRNA。应用质粒重连法检测HR修复效率,将I-SceⅠ酶线性化的HR质粒和siRNA共转染绵羊胚胎成纤维细胞,经72 h培养及流式细胞仪检测,与对照组细胞比较,结果表明HR质粒重连效率提高了3~4倍。瞬间干扰Lig4基因的表达可提高HR质粒重连效率,为改善绵羊胚胎成纤维细胞基因打靶效率提供理论基础。     

利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体

目的利用TALE-TFs,在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子,为检测β-酪蛋白基因启动子—目的基因表达框的表达结果,提供一种检测途径。方法将构建的TALE-TFs和β-酪蛋白基因启动子—Red报告基因质粒电转染进入小鼠成纤维细胞,通过荧光显微镜直接观察报告基因表达情况。结果与结论利用TALE人工转录因子,在小鼠成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框,为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了新的途径。