Cloning and sequence analysis of full length of mulberry (Morus alba ) actin gene

肌动蛋白在植物的各种生理活动中起着重要作用,是研究基因表达与调控模式的内标参考.通过染色体步移方法获得了桑树肌动蛋白actin基因1 612 bp的序列,该基因CDS长1 312 bp(GenBank登录号:HM623866),编码377个氨基酸残基,与水稻、葡萄等的同源基因的序列一致性在90％以上.基因内含子的数目及其在基因组上的位置也与水稻、葡萄等的相似.对来自不同物种的24个肌动蛋白基因进行聚类分析的结果显示,基因被分为Class Ⅰ和ClassⅡ两个明显的亚群.     

水稻minE基因的克隆及分析

 植物叶绿体与原核生物分裂机制相似,其中MinE蛋白在细菌分裂过程中具有重要作用. 为了研究植物MinE蛋白在叶绿体分裂过程中的功能及其进化,利用RT PCR技术克隆了水稻叶绿体分裂相关基因OsMinE,并在GenBank登录（No. AY496951）.OsMinE基因cDNA全长1 035 bp,其ORF为711 bp,编码236个氨基酸.与原核生物MinE蛋白相比,水稻OsMinE具有明显延伸的N端与C端.其N端102个氨基酸残基为预测的叶绿体导肽序列,C端延伸保守,推测赋予植物MinE蛋白新的功能.植物minE基因结构分析显示,水稻、拟南芥、杨树都仅含有1个内含子,且插入位置及相位相同.这表明,该内含子可能在单子叶、双子叶植物分化前产生.水稻OsMinE基因在大肠杆菌细胞中的表达严重影响了细胞的分裂,初步证明了水稻MinE蛋白与原核细胞MinE蛋白功能类似.水稻OsMinE基因的克隆为进一步研究叶绿体的分裂机制奠定了基础.     

三种不同抗冻性葡萄中CBF2基因的生物信息学分析及植物表达载体构建

从赤霞珠、贝达和山葡萄三种不同抗冻性葡萄的基因组DNA中分别克隆了CBF2全长基因,并利用生物信息学的方法进行了分析。结果显示：三种葡萄的CBF2基因长均为969 bp,编码253 个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸相似性在96.7%～97.94%之间。生物信息学分析显示3种不同抗冻葡萄的CBF2基因具有连续的开放阅读框,推倒的氨基酸序列具有AP2结合域,初步判断克隆的CBF2具有诱导抗寒性产生的作用。但氨基酸序列、进化树、理化性质、疏水性/亲水性等在抗寒性较强的山葡萄、贝达与抗寒性较差的赤霞珠之间存在一些差异,与GenBank上的原始序列同源性最低的是赤霞珠,而且其CBF2 N端7个氨基酸残基序列与山葡萄和贝达的氨基酸序列存在较大差异,且具有较强的疏水性,这些差异可能与赤霞珠较弱的抗寒特性有关。以带有35S启动子的载体pBI121为基础,成功构建了植物表达载体pBI121 CaMV35S CBF2,为深入研究CBF2基因在葡萄抗寒性中的作用提供了基础资料。     

白桦肌动蛋白(Actin)基因全长cDNA克隆与序列分析

以白桦(Betula platyphylla Suk.)次生木质部为材料,用改良CTAB方法提取总RNA。根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物后进行RT-PCR,并采用RACE技术扩增出Actin基因全长序列。该基因cDNA全长1 785 bp,序列分析表明,该基因编码区1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区157 bp,3′非编码区495 bp。所得序列与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性高达96%以上。此基因已在GenBank注册（EU588981）。根据高等植物肌动蛋白相似性构建了进化树,表明白桦肌动蛋白与蓖麻肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。     

全雌性黄瓜中3个肌动蛋白基因片段的克隆和表达分析

通过1次PCR扩增从全雌性黄瓜中同时获得了长度分别为1 186bp、955 bp和870bp的3个肌动蛋白基因片段Act1、Act2和Act3(GenBank登记号:DQ115881,DQ115882和DQ115883).序列分析表明,3个肌动蛋白基因片段与GenBank中收录的肌动蛋白基因序列高度同源,与GenBank中收录的全长肌动蛋白基因(如AF386514.1、AF059484.1和AB010922.1等)的第2、第3个外显子和第2个内含子相对应.Act1中1-580 bp、984～1 186 bp,Act2中1-580 bp、753-955bp,Act3中1-580 bp、668-870 bp为外显子编码区,其余为内合子序列,3个基因内含子的两端序列均符合典型的"GT-AG"规则.RT-PCR分析表日月,Act1仅在根中表达,Act2在根和雌花中表达,而Act3在所有检测的器官(包括根、茎、叶、卷须,雌花和幼果)中都表达,提示黄瓜根的生长发育需要多种肌动蛋白基因的参与,而Act2和Act3可能与黄瓜雌性系的形成发育有关.     

球根白丝膜菌γ-actin基因的克隆及表达分析

根据真菌肌动蛋白(actin)基因保守区序列设计引物,用简并PCR法和RACE技术分离得到球根白丝膜菌(Leucocortinarius bulbiger)γ-肌动蛋白基因(Lb-act)的全长cDNA序列。该序列全长为1 357 bp,包含一个1 137 bp的开放阅读框(ORF),编码378个氨基酸,5'端非翻译区(5'UTR)92 bp,3'UTR长度128 bp。Port Param软件在线分析结果表明,该cDNA所编码的蛋白质理论等电点为5.12,相对分子质量为95.022 kD,具有真菌γ-actin基因3个保守特征序列。Blast同源性检索结果表明,Lb-act氨基酸序列与担子菌肌动蛋白序列有较高的相似性,其与双色蜡蘑的肌动蛋白氨基酸序列的亲缘关系最近。Lb-act基因在不同碳源及磷水平培养条件下表达量基本一致,验证了该基因作为分子内标的可靠性。     

兴安落叶松肌动蛋白基因的分离与序列分析

以兴安落叶松(Larix gmelinii)实生苗为材料,提取总RNA和基因组DNA;利用兼并PCR及RACE技术克隆肌动蛋白基因(Lg-act).序列分析的结果显示,该基因cDNA全长1662 bp,编码377个氨基酸;基因组DNA长度约为2564bp,包含4个内含子,5个外显子.所克隆的Lg-act cDNA序列与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在77％以上,氨基酸序列的相似性高达93％以上.根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统树显示,兴安落叶松肌动蛋白与挪威云杉肌动蛋白之间的亲缘关系较为密切,在进化中分化时间最为接近.     

虾夷扇贝β-actin基因的克隆和序列分析

为进一步研究虾夷扇贝功能基因的表达调控。利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了健康虾夷扇贝外套膜和肾脏两种组织的cDNA文库。对随机选取的4009个克隆进行5′端测序,比对,筛选出1条β肌动蛋白同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到肌动蛋白基因cDNA全长序列。肌动蛋白基因cDNA全长1536bp(不包括polyA),5′端非编码区84bp,3′端非翻译区321bp,阅读框1131bp,编码377个氨基酸。在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第41和第42个氨基酸之间,长度为1498bp。系统发育分析显示该肌动蛋白属于β类型。本研究得到的虾夷扇贝β-肌动蛋白基因可以被用于作为定量某种虾夷扇贝mRNA的标准,这为继续研究虾夷扇贝其它功能基因,及其分子生物的进一步研究、促进其他相关分子发育和系统进化研究奠定了基础。     

茶树肌动蛋白基因（CsActin1）全长cDNA克隆与生物信息学分析

以茶树（Camellia sinensis）萌动芽为材料,根据茶树萌动芽芽抑制消减杂交文库中分离得到的肌动蛋白（actin）基因的5′-片段设计引物,利用3′-RACE技术克隆了其cDNA全长序列,该基因cDNA全长1 470 bp,命名为CsActin1（GenBank登录号HQ235647）。序列分析表明,CsActin1开放阅读框长1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区100 bp,3′非编码区236 bp。推测的蛋白质分子量为41.70 kD,等电点约为5.31,具有肌动蛋白家族的特征信号序列（YVGDEAQs.KRG和WIAKaEYDE）和肌动蛋白相关蛋白的特征信号序列（LLTEApLNPkaNR）。CsActin1与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在80%以上,氨基酸序列相似性在95%以上。与其它植物肌动蛋白的进化树分析结果表明,茶树肌动蛋白与杨树的两个肌动蛋白间的亲缘关系最为密切。并对推导的蛋白结构进行了分析。     

甘蔗过氧化氢酶基因的电子克隆及生物信息学分析

应用电子克隆技术,获得甘蔗中一个过氧化氢酶基因的cDNA序列全长,命名为S-CAT。该基因全长2160bp,包含一个1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。通过PSORT工具,预测甘蔗S-CAT蛋白存在于过氧化物酶体中。同源比对分析显示,S-CAT基因编码的氨基酸序列与水稻、玉米、高粱、朝鲜碱茅、葡萄等植物中过氧化氢酶基因所编码的氨基酸序列高度同源,同源性分别为97%,97%,95%,91%和92%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。     

Cloning and expression of an actin gene in the haemocytes of pearl oyster (Pinctada fucata, Gould 1850)

An actin gene (designated pfact1) of pearl oyster, Pinctada fucata, was cloned from haemocytes by the techniques of homological cloning and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The full length of Pfact1 cDNA was 1608 bp in length, having a 5′ untranslated region (UTR) of 82 bp, a 3′ UTR of 395 bp, and an open reading frame (ORF) of 1131 bp encoding a polypeptide of 376 amino acids with a predicted molecular weight of 41.76 kDa and an estimated isoelectric point of 5.29. Sequence analysis revealed that Pfact1 shared high similarity with other actins and was more closely related to vertebrate cytoplastic actins than muscle types. Phylogenetic analysis indicated that molluscan actins could also be generally grouped into two classes: muscle type and cytoplasmic type, although both are similar to vertebrate cytoplastic actins. Fluorescent real-time quantitative RT-PCR was used to examine the expression level of Pfact1 in haemocytes of P. fucata after the challenge of Vibrio alginolyticus, and results showed that Pfact1 exhibited stable expression in all time points, indicating that Pfact1 could be a suitable internal control for gene expression analysis in haemocytes of P. fucata.     

谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析

以谷子 (Setariaitalica)为材料 ,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物 ,用 5’RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序 ,序列分析结果表明 :谷子肌动蛋白基因的编码区长 1 1 3 1个核苷酸 ,编码了 3 77个氨基酸 ;所得序列 (命名为MIAc)与GenBank中注册的肌动蛋白基因序列的相似性均在 6 0 %以上 ,与其它肌动蛋白氨基酸序列的相似性达 89%以上。根据高等植物肌动蛋白序列相似性重建了进化树 ,表明谷子肌动蛋白与水稻肌动蛋白异型体RAc2和RAc3之间的亲缘关系最为密切 ,在进化过程中分化时间最为接近     

谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析

以谷子（Setaria italica）为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析结果表明：谷子肌动蛋白基因的编码区长1131个核苷酸,编码了377个氨基酸;所得序列(命名为MIAc)与GenBank中注册的肌动蛋白基因序列的相似性均在60%以上,与其它肌动蛋白氨基酸序列的相似性达89%以上。根据高等植物肌动蛋白序列相似性重建了进化树,表明谷子肌动蛋白与水稻肌动蛋白异型体RAc2和RAc3之间的亲缘关系 最为密切,在进化过程中分化时间最为接近。     

小麦Na+/H+反转运蛋白基因的克隆和特性

以水稻(Oryza sativa L.) Na+/H+反转运蛋白cDNA片段为探针,从小麦盐胁迫cDNA文库中筛选和克隆了2个小麦Na+/H+反转运蛋白基因,分别命名为TaNHX1 和 TaNHX2.序列分析表明TaNHX1为2 029 bp,包含一个完整的1 638 bp的ORF,编码546个氨基酸,其中含有DIFFIYLLPPI跨膜区.TaNHX2为1 693 bp,包含部分ORF及808 bp的3′-UTR.这2个基因与已知的水稻、拟南芥(Arabidopsis thialiana)和滨藜(Atriplex gmelini)中的同类基因NHX的相似性约为70%.RT-PCR分析表明小麦苗经400 mmol/L NaCl处理1 h后,TaNHX1的转录水平有所提高.     

Hexokinase from grape berries: its prokaryotic expression, polyclonal antibody preparation and biochemical property analyses

Two full-length hexokinase (HXK, EC 2.7.1.1) cDNAs, VvHXK1 with 1,413 bp and VvHXK2 with 1,458 bp were cloned from grape berries (Vitis vinifera L. Cabernet Sauvignon). VvHXK1 and VvHXK2 genes sequence from grape berries were deposited in GenBank under the accession number JN118544 and JN118545, respectively. The homology of the amino acid of VvHXK1 or VvHXK2 was very similar to ‘Pinot Noir’ grape HXK sequence, their similarties were 99.36 % and 98.97 %, respectively. More intuitive phylogenetic tree showed that the homology of amino acid sequence VvHXK1 with melon CmHXK1 was 86 %, and VvHXK2 homology with rice OsHXK3 was 83 %. The HXK proteins were successfully expressed in plasmid pET-30a (+) vectors in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. The expressed proteins were purified using Ni-NTA agarose column and used to produce HXK1 antibody and conducted HXK protein blotting analysis. The results,suggested that one polypeptide band of about 51 kDa HXK protein can be detected in grape berries, HXK protein level was the highest during early grape berry development, but the lowest from 50d to 60d during development. Biochemical analysis of two hexokinase isozymes indicated that glucose was the optimal substrate of HXK, The isoelectric points of the two isozymes were 5.8 and 5.6, respectively. And the optimum pH was about 8.0. These results provide a substantial basis for the further studies of functions of grape HXKs to manipulate sugar content of grape berries.     

毛白杨PtFT1和PtFT2基因编码区克隆与表达模式分析

以毛白杨为材料,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离了FT(FLOWERING LOCUS T)同源基因PtFT1和PtFT2编码区序列。测序结果表明PtFT1和PtFT2 编码区长度均为525bp,可编码174个氨基酸。蛋白序列比对发现这两个基因与拟南芥、葡萄等物种中FT同源基因所编码的氨基酸同源性达到75%以上, PtFT1 和 PtFT2 所推测的氨基酸序列包含FT类蛋白保守基序(LGRQTVYAPGWRQN)和两个关键性氨基酸残基Tyr84(Y),Gln139(Q)。系统进化分析进一步表明 PtFT1 和 PtFT2 属于FT亚家族成员。采用Real-time qRT-PCR技术检测 PtFT1 和 PtFT2 在各个组织部位中的表达模式,结果表明 PtFT1 和 PtFT2 在各个组织部位均有表达,但这两个基因的表达水平存在差异;两个基因在早期雌雄花芽(7月5日)表达量明显高于成熟雌雄花芽(翌年3月10日)表达量,进而推测在毛白杨中 PtFT1 和 PtFT2 的表达响应日照长短,长日照条件促进这两个基因的表达,它们可能在光周期调控的开花途径中促进花芽分化和开花发挥特定作用。这些研究对于阐明 PtFT1 和 PtFT2 在光周期开花调控途径中的作用机制具有重要意义,为进一步开展毛白杨开花调控基因工程研究奠定了工作基础。     

糜子抗旱节水相关基因PmMYB的克隆及表达分析

根据在糜子抗旱节水分子基础研究中获得的一个糜子MYB基因的EST序列, 以其序列及水稻MYB18基因的序列为基础设计引物, 扩增得到1 739 bp的全长基因组序列。序列分析表明, 其包含121 bp(347~467 bp)和93 bp(599~691 bp)的两个内含子, 3个外显子; 全长cDNA序列为1 525 bp, 其中3′非翻译区为212 bp, 5′非翻译区为41 bp, 编码区为1 272 bp, 共编码424个氨基酸, C-端存在一个丝氨酸(Ser, S)丰富区。该基因具有两个典型的MYB类转录因子基因的DNA结合区(DNA-binding domain), 分别为13~63、66~114位氨基酸, 属于典型的R2R3-MYB转录因子。对其与水稻、玉米、火炬松、拟南芥、辣椒、陆地棉、大麦及茄子等9种植物的MYB基因的R2、R3重复区的氨基酸序列多重比较, 表明R2R3重复序列在植物中具有较高的保守性; 基于氨基酸序列的编码区系统进化树分析表明, 不同植物的MYB基因遗传分化很大, 序列相似性为32%~84%, 其中糜子MYB基因与水稻的MYB18相似程度最高(84%), 与大麦和玉米的相似性分别为46%和41%。通过半定量RT-PCR对其表达模式分析表明, 该基因在水分胁迫和干旱后复水条件下上调表达, 与糜子抗旱节水紧密相关。该基因的克隆为进一步探讨利用该基因改良其他植物的抗旱节水性奠定了良好的基础。