浙江产眼镜蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅰ.酶的纯化

用亲和层析法纯化眼镜蛇毒胆碱酯酶440倍左右,比活力达到203毫克分子底物水解/小时/毫克蛋白。亲和吸附剂的制备是以琼脂糖凝胶4B 为载体,己二胺为“手臂”,(间-羧基苯基)-二甲基乙基碘化铵为配基制成,不同长度的“手臂”对酶的吸附有影响,疏水性强的“手臂”对酶的吸附也强。在纯化过程中,胆碱酯酶在凝胶电泳中始终保持6条条带,可能是它的同工酶。兔抗眼镜蛇蛇毒血清对猪脑尾状核乙酰胆碱酯酶、黄姑鱼肌肉胆碱酯酶无免疫交叉反应,对蛇毒胆碱酯酶形成络合物后仍能表现胆碱酯酶的活力,说明酶的抗原决定簇和活性中心不在同一部位。     

浙江产眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶的研究 Ⅱ.酶学性质与生物毒性

浙江眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶具有乙酰胆碱酯酶的特征,有以下几点事实:1.乙酰胆碱酯是酶的最适底物;2.过量底物抑制酶活性;3.BW_(62)C_(47)、BW_(284)C_(51)是典型的真性酶抑制剂,对蛇毒胆碱酯酶也同样具有抑制作用。眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶最适pH为7.5(0.1M磷酸缓冲液)。反应5分钟时的最适温度在38～39℃,K_m值是1.25×10~(-4)M。稀酶溶液不稳定,在0.1%白明胶中可保护酶活力。原蛇毒和纯化后的胆碱酯酶的底物抑制图形和K_m值是类似的,这说明纯化过程中酶没有矫变。蛇毒中的胆碱酯酶被多种有机磷化合物如二异丙基磷酰氟、敌敌畏、对氧磷所抑制。一些氨基甲酸酯和含季铵盐的化合物也表现有抑制。浙江眼镜蛇毒有较大的毒性,小白鼠腹腔注射最小致死剂量是0.88微克/克,用亲和层析分离除去胆碱酯酶后仍保留有蛇毒的毒性,最小致死剂量是0.77微克/克,纯化的胆碱酯酶含7.5微克/克蛋白,动物未致死,说明蛇毒的主要毒性并不是胆碱酯酶。     

浙江产眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅱ.酶学性质与生物毒性

浙江眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶具有乙酰胆碱酯酶的特征,有以下几点事实:1.乙酰胆碱酯是酶的最适底物;2.过量底物抑制酶活性;3.BW_(62)C_(47)、BW_(284)C_(51)是典型的真性酶抑制剂,对蛇毒胆碱酯酶也同样具有抑制作用。眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶最适pH 为7.5(0.1M 磷酸缓冲液)。反应5分钟时的最适温度在38～39℃,K_m 值是1.25×10~(-4)M。稀酶溶液不稳定,在0.1%白明胶中可保护酶活力。原蛇毒和纯化后的胆碱酯酶的底物抑制图形和K_m 值是类似的,这说明纯化过程中酶没有矫变。蛇毒中的胆碱酯酶被多种有机磷化合物如二异丙基磷酰氟、敌敌畏、对氧磷所抑制。一些氨基甲酸酯和含季铵盐的化合物也表现有抑制。浙江眼镜蛇毒有较大的毒性,小白鼠腹腔注射最小致死剂量是0.88微克/克,用亲和层析分离除去胆碱酯酶后仍保留有蛇毒的毒性,最小致死剂量是0.77微克/克,纯化的胆碱酯酶含7.5微克/克蛋白,动物未致死,说明蛇毒的主要毒性并不是胆碱酯酶。     

黄姑鱼肌肉胆碱酯酶的纯化及其某些性质

用亲和层析方法纯化了黄姑鱼(Nibea albiflora)肌肉胆碱酯酶。结合在膜上的胆碱酯酶用两种非离子型表面活性剂的混合液抽提、硫酸铵分级沉淀、再经一次亲和层析,共提纯11,800倍,最高比活力达2180活力单位/毫克蛋白,总活力回收约20%。纯化后的酶用聚丙烯酰胺凝胶电泳,除部分酶蛋白留在原点外,在凝胶内为单一蛋白染色区带,具有酶活力。SephadexG-200凝胶过滤得两个酶活力峰。亲和吸附剂在八个月内反复使用近20次,性能不变。对酶的一般性质作了初步的研究。根据酶的底物专一性、受真性酶专一性抑制剂抑制作用的敏感性及过量底物抑制作用的存在,可以认为黄姑鱼肌肉胆碱酯酶基本上具有真性酶的特征。     

黄姑鱼肌肉胆碱酯酶的纯化及其某些性质

用亲和层析方法纯化了黄姑鱼(Nibea albifiora)肌肉胆碱酯酶。结合在膜上的胆碱酯酶用两种非离子型表面活性剂的混合液抽提、硫酸铵分级沉淀、再经一次亲和层析,共提纯11,800倍,最高比活力达2180活力单位/毫克蛋白,总活力回收约20%。纯化后的酶用聚丙烯酰胺凝胶电泳,除部分酶蛋白留在原点外,在凝胶内为单一蛋白染色区带,具有酶活力。SephadexG-200凝胶过滤得两个酶活力峰。亲和吸附剂在八个月内反复使用近20次,性能不变。对酶的一般性质作了初步的研究。根据酶的底物专一性、受真性酶专一性抑制剂抑制作用的敏感性及过量底物抑制作用的存在,可以认为黄姑鱼肌肉胆碱酯酶基本上具有真性酶的特征。     

浙江产眼镜蛇蛇毒胆碱脂脢的研究 Ⅳ 同工酶

不同来源的胆碱酯酶的分子量和分子形态往往不同,就是同一来源的胆碱酯酶也有天然存在几种同工酶,有些由于不同亚基数组成不同的聚合体,也有在制备或贮藏过程中发生矫变。在前文(佘微明等 1981)报导浙江产眼镜蛇的粗蛇毒或两次亲和层析后的胆碱酯酶在高pH不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中,均表明有六条活力显色同工酶带,我们用此系统改做双向电泳,比较了新鲜蛇毒原液、蛇毒冻干粉及两次亲和层析后的蛇毒胆碱酯酶,酶(Shafai 法 1971)的条带是沿着聚丙烯酰胺凝胶板的对角线分布,见图1。说明这些同工酶并非由于在提纯或电泳过程中产生的矫变。     

舟山眼镜蛇毒神经生长因子的亲和层析分离

用层析和制备SDS-PAGE法纯化舟山眼镜蛇(Najanajaatra Cantor)毒神经生长因子(NGF),免疫家兔获得抗血清。用辛酸-硫酸铵沉淀法初步纯化IgG,蛋白A-Sepharose亲和层析进一步纯化IgG,并与CNBr活化的Sepharose4B偶联,采用亲和层析法对舟山眼镜蛇毒神经生长因子进行分离纯化。产物经过SDS-PAGE检测呈一条带,并显示了良好的生物学活性。纯化NGF最大比活性为5.0×104U/mg蛋白,亲和常数为4.35×108L/mol,亲和层析分离NGF得率比传统分离方法得率提高35.2%,该方法为NGF的大量提取提供了技术支持。     

《动物学研究》增刊简介

《动物学研究》第2卷第4期增刊(1981) 本期增刊为“蛇毒研究与蛇伤治疗”。主要内容是:福建产圆斑蝰蛇(Vipera russclli siamensis)蛇毒磷酯酶A的分离纯化及部分性质;毒性磷酯酶A_2的氨基酸组成和N-末端部分氨基酸顺序测定;浙江蝮蛇毒碱性磷脂酶A的分离纯化及性质;我国10种蛇毒磷脂酶A活力比较;广东金环蛇细胞毒素Ⅷ的化学组成和部分一级结构;眼镜蛇膜毒素对菠菜叶绿体光合膜的影响;中华眼镜蛇毒膜毒素对鼠肝线粒体的作用;眼镜王蛇毒中L-氨基酸氧化酶的分离纯     

眼镜蛇毒中降压因子的提取及其降血压作用的研究

目的：从广西眼镜蛇蛇毒中分离纯化血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor,ACEI),命名为降压因子（Hypotensive Factor,HF）,并测定其生物活性。方法：采用Sephacryl S-100凝胶过滤,CM Sepharose F.F.离子交换层析分离纯化HF,高效液相鉴定纯度,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定其分子量,紫外分光光度法测定HF对血管紧张素转换酶（ACE）的抑制活性。用离体兔子十二指肠平滑肌测定HF增强缓激肽(Bradykinin,BK)的效应。结果：纯化的广西眼镜蛇蛇毒HF经SDS-PAGE检测显示单一条带,测得其相对分子量约为8.2kD,由十二种氨基酸组成,蛋白回收率为5.70%。HF对ACE有明显的抑制作用,其抑制作用与剂量呈正相关。IC50为1.02?g/ml。HF能增强BK对离体兔子十二指肠平滑肌的收缩效应。结论：本方法成功地从广西眼镜蛇蛇毒中纯化出降血压成分。该成分与血管紧张素转换酶抑制剂作用相似,对血管紧张素转换酶有明显的抑制作用。     

广西眼镜蛇毒磷酸二酯酶分离纯化及部分性质

磷酸二酯酶(PDE)广泛存在于各种蛇毒中,在响尾蛇科、蝰蛇科、眼镜蛇科和海蛇科的部分蛇毒中都存在着该酶.不同的蛇毒其PDE活力及含量有很大差异.即便在生物学分类上十分接近的蛇种,其PDE活力亦相差甚远.该酶是核酸结构分析的一种重要工具酶,具有核酸水解酶作用,是一种核酸外切酶,它能从3'-端顺序地降解核糖或脱氧核糖多核苷酸,生成5'-单核苷酸.该酶既能水解DNA又能水解RNA,因而在核酸的鉴定和序列测定方面获得了广泛的应用.由于蛇毒PDE在核酸顺序测定中显示的重要性,因而对各种蛇毒纯化PDE的研究工作引起了国内外学者的广泛兴趣.王殿洪等[1]曾对江西蝮蛇毒中PDE的分离纯化及某些性质做过报道,但广西眼镜蛇毒中PDE的分离纯化及性质在国内外均未有报道.广西有丰富的眼镜蛇毒资源,而且有高活性的PDE.蛇毒PDE的生物学活性,国外研究得较少.它没有出血、凝血、纤溶及致死作用.蛇毒PDE水解核糖核酸产生5'-单核苷酸,5'-单核苷酸在医药上均有十分重要作用,制成药物治疗白血病和血小板减少症等.     

蛇毒中γ-谷氨酰转肽酶

γ-谷氨酰转肽酶 (简称γ-GT)广泛存在各种哺乳动物组织中,在氨基酸转运中起重要作用。我们对分属于眼镜蛇科、蝰科和海蛇科的九种毒蛇的蛇毒进行研究,发现蛇毒中存在γ-GT,但各种蛇毒的总酶活力差异很大,以眼镜王蛇和眼镜蛇毒含量较丰富。聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶等电聚焦电泳分析指出,大多数蛇毒含多种形式的γ-GT,存在分子量与等电点不同的酶区带。     

魔竽葡苷聚糖凝胶为亲和层析载体与Sepharose 4B的比较研究——Ⅰ.KGM金属螯和层析分离纯化猪血SOD

将KGM凝胶和Sepharose 4B在同样条件下活化偶联,制成Cu~(2 )金属螫合亲和胶,亲和纯化猪血SOD,并对这两种亲和胶的层析效果和性能进行了比较。KGM金属螫合胶对猪血SOD吸附量、纯化倍数、纯化SOD的比活力和回收率分别为53000U/ml胶、19倍、12000U/mg蛋白和94.6％,而Sepharose 4B亲和胶对SOD 的吸附量、纯化倍数、纯化SOD的比活力和回收率分别为79920U/ml胶、11倍、10125U/mg蛋白和95.4％。两种亲和胶所纯化的SOD经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、活性染色及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明其均为电泳纯。KGM金属螯合胶使用六次后,其对SOD吸附量、去Cu量及SOD的回收率均无明显影响。     

浙江产眼镜蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅲ、酶的疏水层析行为

本文报导了三种疏水层析吸附剂的制备,并比较了这几种吸附剂对浙江产眼镜蛇毒胆碱酯酶的吸附情况,它们都能吸附这种酶、烷基越长吸附得越牢。经此疏永层析后的酶,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中依旧有6条同工酶带,提示这些同工酶的疏水性质相似。     

组蛋白-亲和层析分离猪心cAMP激活的蛋白激酶

本文报导用亲和层析分离猪心蛋白激酶的结果,以及对这个酶的性质的初步观察。亲和吸附剂的配基为全组蛋白,它与琼脂糖4B或直接相联;或分别通过丙氨酸、甘氨酰甘氨酸、亮氨酰甘氨酰甘氨酸三种不同长度“手臂”的活化酯,在温和的条件下相联。上述四种亲和吸附剂的分离效果以双甘肽为“手臂”的最好。猪心粗抽液经亲和层析一步分离得到的蛋白激酶,其比活提高五十倍左右,活力回收达百分之五十。初步测定了这个酶的分子量、等电点、对ATP的K_m和cAMP的结合常数,观察到它对cAMP可能有两种结合部位。活力保存实验表明,酶在甘油中4℃保存四个月活力不变,cAMP激活性质也不变。     

魔竽葡苷聚糖凝胶为亲和导析载体与Sepharose 4B的比较研究

将KGM凝胶和Sepharose 4B在同样条件下活化偶联,制成Cu2 金属螯合亲和胶,亲和纯化猪血SOD,并对这两种亲和胶的层析效果帮性能进行了比较,KGM金属螯合胶对猪血SOD吸附量,纯化倍数,纯化SOD的比活力和回收率分别为53000U／ml胶,19倍,12000U/mg蛋白和94．6％,而epharose 4B亲和胶对SOD的吸附量,纯化倍数,纯化SOD的比活力和回收率分别为7992U／ml胶,11倍,10125U/mg蛋白和95．4％,两种亲和胶所纯化的SOD经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,活性染色及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）证明其均为电泳纯,KGM金属螯合胶使用六次后,其对SOD吸附量,去Cu量及SOD的回收率均无明显影响。     

蓝色染料配基亲和纯化眼镜蛇心脏毒素的研究

探索了蓝色染料（Cibacron Blue F3G-A）亲和分离中华眼镜蛇心脏毒素的可能性。采用环氧基活化法制备蓝色染料亲和介质,中性条件下提取眼镜蛇粗毒中的心脏毒素。Tricine系统SDS-PAGE多肽电泳和Lowry法蛋白定量分析纯化效果,发现蓝色染料琼脂糖一步纯化中华眼镜蛇心脏毒素的纯度达到84%,结合量为6.9mg/ml介质。这是首次利用小分子亲和配基纯化心脏毒素。与生物大分子配基相比,活性染料分子具有价格便宜,易于合成,性质稳定,不易降解和适合大规模生产等优点。     

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶的性质研究

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶是溶解状态的酶。我们制备了四种接有不同配位基或手臂的亲和凝胶,对酶的亲和层析行为作了比较。结果表明,不仅配位基的性质对酶的结合有关,而且手臂的疏水性质也影响酶的结合。用N-甲基吖啶为配位基的凝胶将粗酶制剂纯化了480倍。该酶对碘化硫代乙酰胆碱的米氏常数K_m为6.8×10~(-6)M,对抑制剂BW284C51的可逆抑制常数K_4为1.03×10(-6)M,过量底物使酶活力受到抑制。另外,我们还初步观察到不同季节的材料,其酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离图谱有所差异。     

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶的性质研究

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶是溶解状态的酶。我们制备了四种接有不同配位基或手臂的亲和凝胶,对酶的亲和层析行为作了比较。结果表明,不仅配位基的性质对酶的结合有关,而且手臂的疏水性质也影响酶的结合。用N-甲基吖啶为配位基的凝胶将粗酶制剂纯化了480倍。该酶对碘化硫代乙酰胆碱的米氏常数Km为6.8×10~(-5)M,对抑制剂BW284C51的可逆抑制常数Ks为1.03×10~(-5)M,过量底物使酶活力受到抑制。另外,我们还初步观察到不同季节的材料,其酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离图谱有所差异。     

用高碘酸盐活化葡聚糖凝胶制备亲和吸附剂的研究

 <正> 用高碘酸盐活化的Sephadex与鸡卵类粘蛋白偶合制备分离纯化胰蛋白酶的亲和吸附剂。该方法比CNBr活化Sepharose 4B制备亲和吸附剂的方法具有操作安全,价格低廉等优点。活化载体在4℃保存较长时间不失去键合能力。该亲和吸附剂可制备得比活力为11228.8u/mgBAEE单位电泳单带纯胰蛋白酶,并能反复使用十余次,仍具有较强亲和吸附能力。酶     

蛇毒的研究和利用 Ⅰ.我国几种常见毒蛇的蛇毒酶活力的测定

本文对我国几种常见的毒蛇,即五步蛇、蝮蛇、竹叶青蛇、金环蛇、银环蛇、眼镜王蛇以及4种不同产地的眼镜蛇的蛇毒的12种酶活力进行了测定,报告了各活力的数值并对这些结果进行了讨论。