应用小动物活体成像追踪观察EGFP标记的间充质干细胞

为探讨干细胞移植治疗过程中干细胞在体内的存活和迁移能力,利用非细胞损伤性的EGFP(enhanced green fl uorescence protein)标记间充质干细胞进行了实验研究。该研究用电穿孔方法将加强的绿色荧光蛋白表达质粒p CMV-EGFP(cytomegalovirus-EGFP plasmid)转染细胞产生具有EGFP标记的牙髓干细胞、皮肤成纤维细胞(skin fi broblast cells,SFCs)和脐带间充质干细胞。将EGFP标记的脐带间充质干细胞注射到裸鼠皮下,用小动物活体成像系统观察了EGFP标记细胞在体内移植后细胞存活能力和荧光强度随时间的变化情况。结果表明,电穿孔转染能够在体外产生高效表达EGFP的标记细胞,EGFP在牙髓干细胞、SFCs和脐带间充质干细胞中的表达率分别为80%、85%和80%。通过小动物活体成像系统检测表明,EGFP标记的脐带间充质干细胞注射到裸鼠皮下后EGFP荧光表达在7 d后逐渐下降,但免疫组化分析表明,移植细胞可存活6个月以上。该研究提示,EGFP标记的干细胞可用于体内追踪其存活、迁移及分化,为探讨干细胞移植治疗作用提供了实验证据。     

三种不同转染剂介导钆喷酸葡胺标记人脐带间充质干细胞及体外MR成像的实验研究

人脐带组织富含间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）,是干细胞研究理想的种子来源,如何从脐带组织中分离间充质干细胞及运用影像技术示踪干细胞生物学行为是当前研究的热点。该实验应用组织块贴壁法从足月孕妇脐带组织中分离纯化间充质干细胞并进行鉴定,结果为hUCMSCs。进一步应用磷酸钙、Effectene、脂质体2000三种转染试剂分别介导Gd-DTPA标记hUCMSCs,通过MRI（magnetic resonance imaging）检测钆喷酸葡胺（Gd-DTPA）标记细胞信号强度变化及细胞内钆离子浓度的测定评价三种转染试剂的转染能力,最终发现在三种转染试剂中,Effectene介导Gd-DTPA标记hUCMSCs效果最佳,为Gd-DTPA标记干细胞体外MR成像奠定了实验基础。     

下调人脐带间充质干细胞Mbd3基因shRNA慢病毒的构建及鉴定

研究构建靶向抑制人Mbd3表达的sh RNA慢病毒颗粒,感染人脐带间充质干细胞并用嘌呤霉素筛选获得Mbd3稳定下调的细胞系,为进一步探讨Mbd3在诱导型多潜能干细胞形成中的作用提供实验基础。研究根据Gene Bank中公布的Mbd3基因序列设计特异性si RNA干扰序列并合成可产生sh RNA的双链DNA,经双酶切后克隆至p LVsh RNA-EGFP(2A)Puro载体上构建慢病毒重组质粒,转化DH5α大肠杆菌PCR检测筛选阳性质粒,利用HEK293Ta包装产生含有Mbd3sh RNA的慢病毒颗粒。通过RT-PCR和Western blot检测慢病毒感染人脐带间充质干细胞(h UC-MSC)后Mbd3的转录和蛋白表达情况,进一步检测重组慢病毒对Mbd3的沉默效果并筛选出最佳抑制效果的sh RNA慢病毒载体。结果显示成功构建并筛选出下调Mbd3的最佳慢病毒干扰载体,慢病毒感染人脐带间充质干细胞48h后于荧光显微镜下可见绿色荧光,经嘌呤霉素筛选9 d后,RT-PCR检测Mbd3表达显著降低,Western blot检测Mbd3蛋白表达明显减少。说明构建的sh RNA重组慢病毒包装成功,具有较高的感染活性,可有效抑制人脐带间充质干细胞Mbd3的表达,为后续研究脐带间充质干细胞跨胚层分化打下前期研究基础。     

慢病毒介导神经生长因子过表达诱导脐带间充质干细胞向神经元样分化

目的探讨神经生长因子(NGF)过表达慢病毒转染脐带间充质干细胞(UMSCs)对细胞分化的影响。方法分离培养UMSCs,流式细胞术鉴定后利用慢病毒载体感染细胞,使其过表达NGF,72h后,通过免疫荧光检测NGF和GFP的表达,Western blot检测NGF蛋白表达水平,ELISA法检测细胞上清液NGF的含量,qRT-PCR检测相关神经因子基因的表达。结果流式细胞术显示细胞表面CD105、CD90、CD73阳性而CD34、CD45、CD19和CD14阴性,鉴定为脐带间充质干细胞。慢病毒转染后细胞NGF和GFP阳性,细胞内NGF和培养液中b-NGF含量都显著性增加,NGF、nestin、GFAP、MAP2及tubulin等mRNA的表达显著性增加。结论神经生长因子过表达慢病毒转染脐带间充质干细胞会促使细胞向神经元样细胞分化,可应用于后续研究。     

慢病毒重组同源盒基因HOXA4表达载体的构建及其感染人脐带间充质干细胞的实验性研究

目的 构建携带同源基因HOXA4的慢病毒表达载体,并测定其对人脐带间充质干细胞的感染效率.方法 使用酶切及PCR技术从含有HOXA4基因的质粒克隆模版HOXA4-MSCV逆转录载体中获取目的 基因HOXA4,并将HOXA4基因重组到慢病毒载体表达质粒上Lenti-GFP-CTB,通过酶切、测序验证HOXA4基因后,将Lenti-GFP-HOXA4质粒、和辅助包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、PMD2G共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带HOXA4基因的重组慢病毒Lentiviral-HOXA4;然后感染人脐带间充质干细胞,通过荧光显微镜及流式细胞术检测其感染效率.结果 成功构建携带HOXA4基因的慢病毒表达载体Lentiviral-HOXA4,并获得高纯度的慢病毒浓缩液.经检测病毒滴度达2.11×108 TU/ml.成功转染HOXA4基因的脐带间充质干细胞表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数（MOI）值为60时转染效率最高,达（95.4±4.3）%.结论 成功构建携带人HOXA4基因的慢病毒,并可以在体外有效转染人脐带间充质干细胞.     

体外传代对版纳微型猪骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白表达的影响

目的通过分离扩增版纳微型猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)观察传代对慢病毒转染的绿色荧光蛋白(GFP)表达的影响。方法采集4月龄版纳微型猪的骨髓,在DMEM/F12培养液中分离间充质干细胞(MSCs),并根据其形态学、抗原标志表达和分化潜能给予鉴定。MSCs与GFP慢病毒载体共培养,荧光显微镜观察GFP的表达,流式细胞仪检测传代后MSCs GFP表达率的变化。标记后传代至1、2、3、4代细胞间比较用非参数检验。结果采用直接培养骨髓,可以分离到高表达CD13、CD29、CD90、CD105的MSCs,并可诱导分化为脂肪、骨和软骨细胞。MSCs与携带GFP的慢病毒载体共培养3天即可观察到GFP的表达,最佳转染复数(MOI)值为50,最佳共培养时间为6 d。传代后MSCs GFP表达率呈下降趋势[1代转染率(42.3±2.25)%、2代转染率(41.6±2.65)%、3代转染率(41.4±3.75)%和4代转染率(38.2±4.75)%],但传至4代GFP表达率的变化差异无统计学意义(P0.05)。结论采用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液可以从版纳微型猪骨髓中分离到MSCs,GFP慢病毒转染是标记MSCs的有效方法,连续传代4代不会显著影响GFP的表达。     

NGF基因重组慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的:构建神经生长因子(NGF)的慢病毒表达载体,并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达情况。方法:采用实时定量PCR(RT-PCR)方法获取NGF基因编码片段,并将构建的慢病毒载体质粒与包装质粒和包膜质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒。应用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞(MSCs),观察转染后细胞的生长形态及生长曲线,再采用RT-PCR、Western Blot方法检测NGF m RNA、蛋白质的表达水平。结果:经PCR、酶切和测序结果证明成功构建NGF基因重组慢病毒载体。同时NGF基因重组慢病毒载体能够成功转染人脐带间充质干细胞,转染率达95.35%,转染后干细胞在NGF m RNA及蛋白质的表达方面较对照组明显升高,同时经倒置显微镜观察及生长曲线实验证实转染后干细胞的生长与对照组相比无明显差异。结论:重组NGF的慢病毒表达载体能够高效的转染人脐带间充质干细胞,基因转染后干细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义,可作为一种高效的干细胞转染方法。     

MRI体外示踪SPIO标记人脐带间充质干细胞的实验研究

目的:研究超顺磁性纳米铁颗粒(superparamagnetic ironoxide particles,SPIO)体外标记人脐带间充质干细胞(HuCMScs)及MRI成像示踪的可行性.方法:从人胎儿脐带中分离培养、扩增脐带间充质干细胞(HUCMSCs),分别采用0 μg/ml,25μg/ml,50μg/ml浓度的SPIO标记0.5×106,1×106,2×106和10×106 HUCMSCs.普鲁士蓝染色和透射电镜鉴定细胞内铁颗粒情况,并用3.0T MR/离体扫描T1WI,T2WI,GRE/300序列成像,测定细胞群信号.结果:不同数量的HUCMSCs与0 μg/ml,25 μg/ml,50 μg/ml浓度的SP10共同培养18小时,普鲁士蓝染色发现标记的细胞随标记浓度的升高染色程度逐渐加深.透射电镜检查显示细胞内含致密铁颗粒.离体MRI不同序列测定不同浓度SPIO标记相同数量的细胞群,GRE/30°和T2WI测定的各组之间均有统计学差别,501μg/ml与25μg/ml组分别与0μg/ml组之间有显著统计学差别(P<0.05);同一浓度SPIO标记人脐带间充质干细胞,信号强度与细胞数量有关(P<0.05).结论:SPIO可以标记人脐带间充质干细胞,应用MRI可以对其进行体外示踪和监测.     

造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选

目的对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析,筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠,为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模型。方法采用活体荧光影像系统对两种红色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN（CAG-DsRed-1和CAG-DsRed-2）ZLFILAS和三种绿色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN（CAG-EGFP-1、CAG-EGFP-2和CAG-EGFP-3）ZLFILAS的荧光标记进行比较;采用流式细胞术检测各转基因小鼠的骨髓lin（-）c-kit（＋）Sca-1＋（LSK）造血干细胞荧光标记细胞比率,根据标记比率筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠。结果活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或绿色荧光。流式细胞术检测表明LSK造血干细胞中高度表达红色和绿色荧光,其中,C57BL/6J-TgN（CAG-DsRed-1）ZLFILAS和C57BL/6J-TgN（CAG-EGFP-1）ZLFILAS的造血干细胞全部为荧光标记细胞。结论筛选获得在造血干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠,可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具。     

人脐带间充质干细胞静脉输注小鼠的安全性

目的探讨C57／BL6J小鼠重复多次尾静脉输注人脐带间充质干细胞后的免疫反应和毒性。方法将SPF级别的32只C57／BL6J小鼠随机分为阴性对照组、细胞移植组,每组16只,雌雄各半,细胞移植组小鼠尾静脉注射分离培养的第5代人脐带间充质干细胞,一次5×10。／只,每周注射一次,连续注射4周;阴性对照组每次注射相同容积的PBS。注射后后观察小鼠的一般症状,末次注射后i周、4周进行血细胞计数、血生化、免疫反应指标、脏器质量测定和组织病理学检查。结果细胞移植组小鼠血细胞计数、血生化、脏器重量和脏器系数与对照组无显著性差异（P〉0．05）,脏器组织病理学在光镜下检查结果与对照组无形态学差别,以及免疫结果测定（T细胞亚群CD3＋、CD4＋、CD8＋及CD4＋／CD8＋）与对照组无显著性差异（P〉0．05）。结论人脐带间充质干细胞重复多次尾静脉输注C57／BL6J小鼠是安全可行的,对受者无明显免疫反应和毒副作用。     

hESC衍生间充质干细胞可显著促进体外血管生成

人胚胎干细胞(hESC)是具有体外无限增殖能力和多向分化潜能的一类亚全能干细胞,在特定的条件下可被诱导分化为机体的各种细胞包括间充质干细胞(MSC)。该研究以人脂肪间充质干细胞(ADSC)和脐带间充质干细胞(UC-MSC)为对照,对hESC衍生间充质干细胞(hESC-MSC)在体外血管生成中的作用进行了系统的研究,包括其条件培养上清对脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的功能和向血管内皮细胞分化潜能的影响。研究发现,hESC-MSC的条件培养上清可显著促进HUVEC的增殖和迁移,其促进HUVEC增殖的作用显著高于UC-MSC的条件培养上清;hESC-MSC经不同血管内皮细胞诱导方案诱导后均具有体外类血管网络生成的能力,其网络长度均显著高于ADSC和UC-MSC经单一血管内皮细胞诱导方案诱导后的长度。因此,hESC-MSC可显著促进体外血管生成,提示该细胞有望成为一种有效的治疗新型心血管疾病的细胞。     

人脐带和骨髓间充质干细胞体外分离培养及生物学特性比较

目的体外分离培养、扩增人脐带间充质干细胞(h UC-MSC)和人骨髓间充质干细胞(h BM-MSC),并对其生物学特性进行比较。方法采用组织块贴壁法从足月胎儿脐带分离、纯化和培养h UC-MSC,健康成人骨髓肝素抗凝后,采用密度梯度离心法分离、纯化和培养h BM-MSC;用倒置显微镜观察两种细胞的形态及细胞生长增殖情况,流式细胞仪分析检测第3代细胞表面标志的表达,Von?Kossa染色及油红O染色检测分化潜能。结果镜下两种细胞均为贴壁生长,形态为均一的成纤维细胞样,取相同数量的细胞传代接种后,h UC-MSC的增殖速率快于h BM-MSC,两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29、CD44、CD105,不表达CD45、CD34、HLA-DR、HLA-G、CD80、CD86,两种细胞都有成骨、成脂分化潜能,但h UC-MSC的分化潜能更强。结论 h UC-MSC与h BM-MSC具有相似的生物学特性,且前者具有更强的增殖能力和分化潜能,h UC-MSC有望成为h BMMSC理想的替代来源。     

人脐带间充质干细胞食蟹猴连续静脉输注后免疫毒性与免疫调节作用研究

该文旨在研究人脐带间充质干细胞在食蟹猴体内的免疫毒性与免疫调节特性。连续14天给予食蟹猴不同剂量(2.0×10~6个·kg~(-1)和2.0×10~7个·kg~(-1))的人脐带间充质干细胞静脉滴注,检测食蟹猴血清IgG浓度、抗人脐带间充质干细胞抗体、淋巴细胞活化增殖和T细胞亚群的变化,以及胸腺和脾脏组织学变化。结果显示,连续14天静脉给予人脐带间充质干细胞对食蟹猴血清IgG浓度无影响,不刺激动物产生抗人脐带间充质干细胞抗体。人脐带间充质干细胞显著抑制食蟹猴淋巴细胞的活化增殖,降低CD3~(+)T细胞比例,刺激Treg细胞的增殖分化。组织学检查发现,部分动物出现与给药相关的胸腺皮质萎缩和脾脏淋巴生发中心增多增大。该研究得出,人脐带间充质干细胞的免疫毒性极低,静脉输注后不引起食蟹猴体内免疫排斥等异常反应,提示其在临床上异体应用的安全性。     

诱导人脐带间充质干细胞向心肌细胞分化及对小鼠心肌梗死的治疗作用

目的研究脐带间充质干细胞(UC-MSC)体外分化为心肌细胞的可行性以及观察UC-MSC体内移植对心肌梗死模型小鼠的治疗效果。方法 10μmol/L 5-氮胞苷(5-aza)体外诱导UC-MSC 14 d,通过RT-PCR、免疫荧光染色鉴定其分化效果;采用腹腔注射盐酸异丙肾上腺素(ISO)每只3.0 mg/(kg/d),制作心肌梗死模型鼠;在注射ISO 48 h后,实验组将DAPI标记的UC-MSC经两次尾静脉移植给心肌梗死模型鼠,移植后第4周和第8周,分别采集实验小鼠的心脏、脾脏,以未移植细胞组的小鼠心肌损伤模型作为对照,通过心脏指数和脾脏指数测量,免疫荧光和碱性复红-苦味酸(HBFP)染色鉴定其体内分化和修复作用。结果 RT-PCR分析表明诱导的UC-MSC表达心肌特异性基因:心肌α-actin、TBX5、GATA4和NKx2.5,免疫荧光染色显示诱导细胞呈心肌α-actin和NKx2.5阳性,且呈双核现象。尾静脉移植后第4周和第8周,模型受体鼠心脏均发现有DAPI阳性细胞迁移至心肌组织且呈现心肌α-actin阳性,HBFP染色及心脏和脾脏指数结果显示移植UC-MSC对心肌损伤的模型鼠有明显的修复和治疗效果。结论 UC-MSC在体外经5-aza诱导可定向分化为心肌细胞,尾静脉体内移植UC-MSC对心肌损伤小鼠有明显的治疗效果。     

CDX2基因修饰的脐带间充质干细胞向杯状细胞分化的可行性研究

目的:研究尾型同源盒2(CDX2)在脐带间充质干细胞(UC-MSC)中过表达后粘蛋白2(MUC2)的表达情况,探寻利用基因修饰使UC-MSC大量表达MUC2的实验方法,了解诱导UC-MSC向内胚层分化对UC-MSC大量表达MUC2的必要性,为研究诱导UC-MSC向杯状细胞分化奠定基础。方法:实验分为5个组,分别为单转组(CDX2转染UC-MSC)、单诱组(仅诱导UC-MSC向内胚层细胞分化)、诱转组(诱导UC-MSC向内胚层细胞分化后,再将CDX2转染诱导后细胞)、空转组(不进行任何诱导但转染空质粒)和对照组(UC-MSC不做任何处理);为排除转染试剂本身的影响,单诱组在诱导分化后仍须转染试剂处理,但不加质粒;各组最后检测CDX2、MUC2的mRNA表达情况;内胚层细胞诱导利用重组人Activin A、重组人Wnt3a实现。结果:单转组、诱转组和空转组细胞在转染48 h后在荧光显微镜下能看到绿色荧光;单诱组和诱转组经诱导培养5 d后,内胚层标志物GATA4的表达增加27倍,Sox17的表达增加54倍。对5组细胞行RT-PCR检测MUC2与CDX2的mRNA表达情况,结果单转组CDX2升高113倍,MUC2升高30倍;诱转组CDX2升高196倍,MUC2升高98倍;空转组、单诱组中CDX2与MUC2的表达无明显变化。结论:在UC-MSC中过表达CDX2能够增加杯状细胞标志物MUC2的表达,而事先诱导UC-MSC向内胚层细胞分化,能进一步增加MUC2的表达。利用CDX2的过表达有使UC-MSC向杯状细胞分化的可能性,而Activin A、Wnt3a的诱导处理能促进其分化能力。     

IFN-β基因修饰的人脐带源性间充质干细胞抑制A549和H226肺癌细胞的克隆、迁移和增殖能力

目的探讨干扰素-β(interferon-β,IFN-β)基因修饰的人脐带源性间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,huc MSCs)对非小细胞肺癌细胞株A549和H226克隆形成、迁移和增殖能力的影响。方法按照慢病毒IFN-β感染huc MSCs条件分为以下5组:慢病毒组、阴性对照病毒组、间充质干细胞组、干扰素组、空白对照组。将IFN-β慢病毒感染huc MSC,荧光显微镜观察荧光表达,确定最佳感染复数(multiplicities of infection,MOI)值,以最佳MOI值感染huc MSCs细胞。达到稳定感染后收集慢病毒组、阴性对照病毒组和间充质干细胞组的上清,ELISA法和Western blot检测以上3组的IFN-β表达的水平。克隆形成实验、Transwell小室迁移实验、细胞增殖-毒性检测法(CKK-8)检测A549、H226细胞克隆形成、迁移和增殖能力。结果慢病毒组和阴性对照病毒组的慢病毒感染效率均在85%以上,慢病毒组的IFN-β表达水平明显高于阴性对照病毒组和间充质干细胞组,慢病毒组A549细胞和H226细胞的克隆形成、迁移能力和增值能力明显降低。结论 IFN-β修饰的huc MSCs能显著抑制非小细胞肺癌细胞株A549和H226的克隆形成、迁移及增值能力,有望成为治疗非小细胞肺癌的一种新途径。     

大鼠脂肪间充质干细胞在体内向肝细胞样细胞方向的转化

目的:探讨大鼠脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)在体内向肝细胞样细胞转化的可能性.方法:将从4周龄雄性SD大鼠腹股沟分离得到的原代脂肪间充质干细胞传至第3代,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)在体外标记后,通过门静脉注射的方法移植入由四氯化碳造成慢性肝损伤的雄鼠体内.移植术后2周处死受体雄鼠,取其肝组织.通过免疫荧光双染色的方法观察BrdU标记细胞的存在和白蛋白的表达,以确定所注入的脂肪间充质干细胞在受鼠体内向肝细胞样细胞转化的情况.结果:在经门静脉注射法进行移植的实验组SD大鼠的肝组织内检测到同时表达BrdU和白蛋白的细胞.讨论:本研究证明了脂肪间充质干细胞在体内有向肝细胞样细胞转化的可能.     

人脐带间充质干细胞在组织工程中的研究进展

人脐带间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞,具有来源广泛、易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点.流式细胞仪分析发现人脐带间充质干细胞高表达间质细胞标志(CD44、CD105)、整合素受体(CD29、CD49b、CD49c、CD51),不表达造血系标志(CD34、CD45)人白细胞抗原HLA-DR和内皮细胞标志CD31.人脐带间充质干细胞在体内外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞等.目前人脐带间充质干细胞在组织工程骨、人工血管以及基因治疗等临床应用研究中已逐渐深入,并已显示出广阔的应用前景.本文就人脐带间充质干细胞的生物学特性及其在组织工程中的研究作一综述.     

microRNA499 慢病毒载体转染诱导大鼠骨髓间充质干细胞 向心肌样细胞分化*

目的:探讨microRNA 499(miR-499)慢病毒转染对诱导大鼠骨髓来源间充质干细胞(BM-MSCs)向心肌样细胞分化的作用。方法:取第四代Wistar大鼠骨髓来源间充质干细胞进行流式细胞检测,鉴定干细胞表面特异标记物。使用符合干细胞鉴定标准的细胞批次用于后续实验。实验设置miR499慢病毒转染、慢病毒空白转染2个处理组,分别于处理后即日、1d,3d,5d,7d收集细胞进行下列实验:实时荧光定量PCR检测心肌重要转录因子GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达,western-blot检测心肌特异蛋白I(cTnI)的表达。结果:培养第四代Wistar大鼠骨髓来源间充质干细胞表达干细胞表面特异标记物,可用于实验。大鼠骨髓来源间充质干细胞microRNA 499慢病毒载体转染后microRNA 499表达明显升高,且转染后1d,3d,5d,7d,GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达逐渐增强。慢病毒空白转染组未见明显变化。western-blot检测自第3天开始可见cTnI阳性表达条带,慢病毒空白转染组未检测到明显阳性表达条带。结论:microRNA 499可诱导大鼠骨髓来源间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人特异性受体Notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中Notch1表达的影响,以便进一步研究Notch1的生物学功能.方法:设计合成Notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定.通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒栽体pGsadeno-Notch1-shRNA.经PacI线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒.产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质千细胞,RT-PCR和Western blot 检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中Notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确.重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内Notch1的转录及蛋白表达水平.对Notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31％和86.97％,具有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建了表达人Notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究Notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础.