降解2,4-二氯酚微生物的分离及其2,4-二氯酚羟化酶基因的克隆和表达

从土壤中分离到一株降解2,4-二氯酚能力较强的细菌菌株GT241-1,经鉴定该菌株属于假单胞菌属。菌株GT241-1在最适条件下能在48h内将90mg/L的2,4-DCP降解91%,能利用2,4-二氯酚、2,4-二氯苯氧乙酸、苯甲酸和儿茶酚为唯一碳源生长。采用Southern杂交对2,4-二氯酚羟化酶基因（dcpA）定位后构建基因组文库,再用斑点杂交筛选目的转化子,克隆了该菌株的dcpA。序列测定得知含dcpA的亚克隆片段全长2389bp,其中dcpA基因编码区1797bp。核苷酸和氨基酸序列分析表明,dcpA与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异。dcpA基因能够在大肠杆菌转化子中成功地表达有生物活性的酶。     

操纵茶树类黄酮3′-羟基化酶生物合成B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物

【目的】操纵茶树类黄酮3′-羟基化酶,生物合成B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素。【方法】构建了4个茶树类黄酮3′-羟基化酶基因(CsF3′H)和拟南芥的P450还原酶基因(ATR)融合表达质粒:SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR2[75-711]3 AA和SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR2[75-711]3 AA,分别转化大肠杆菌菌株TOP10、DH5α和BL21,获得12个转化菌株S1–S12;构建了茶树类黄酮3′-羟基化酶基因CsF3′H表达质粒p YES-Dest52-CsF3′H,转化酵母菌株WAT11,得到转化菌株S13;构建了茶树类黄酮3′-羟基化酶基因CsF3′H表达质粒pES-URA-CsF3′H,及茶树黄烷酮3-羟基化酶基因CsF3H与拟南芥黄酮醇合成酶基因At FLS的融合表达质粒pES-HIS-CsF3H::At FLS 9AA,二者共转化酵母菌株WAT11,获得转化菌株S14。【结果】转化SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR1[49-688]3 AA质粒的TOP10菌株S6在25°C条件下发酵,转化效率最高,能将1000μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,分别转化生成287.93μmol/L圣草酚、131.76μmol/L二氢槲皮素和188.62μmol/L槲皮素。发酵菌株S13能分别将1000μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,最多能转化生成734.32μmol/L圣草酚、446.07μmol/L二氢槲皮素和594.64μmol/L槲皮素。喂食S14发酵菌株5 mmol/L的底物柚皮素,在发酵36–48 h中,最多能生成1412.16μmol/L圣草酚、490.25μmol/L山奈酚、445.75μmol/L槲皮素、66.75μmol/L二氢槲皮素和73.50μmol/L二氢山奈酚。【结论】本研究首次将茶树类黄酮3′-羟基化酶基因应用于B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素的生物合成。     

2-羟基-4-甲氧基苯甲醛缩苯胺对菜青虫酚氧化酶的抑制作用

为筛选对十字花科蔬菜害虫菜青虫Pieris rapae（L.）酚氧化酶具有高抑制活性的化合物,为寻找新型害虫控制剂提供线索,采用酶标仪微量法以室内合成、筛选的高活性化合物2-羟基-4-甲氧基苯甲醛缩苯胺为抑制剂,研究了其对菜青虫酚氧化酶的抑制活性及抑制类型。结果表明,供试化合物对菜青虫酚氧化酶的抑制中浓度（IC₅₀）为0.116 mmol/L;该化合物为典型的可逆非竞争型抑制剂,抑制常数（K_i）为1.96 mmol/L。该化合物直接对靶标酚氧化酶产生作用,而不是通过影响酶结构内的铜离子来产生作用的。     

鼻咽癌5-8F细胞膜蛋白质组初步分析

细胞膜蛋白是细胞的重要组成部分,作为细胞的"门铃"与"门户",参与细胞内外物质交换、信息转换、细胞生长发育、细胞迁移以及免疫应答等重要生理活动.为鉴定鼻咽癌转移相关膜蛋白,运用差速离心联合双水相方法分离纯化鼻咽癌高转移细胞5-8F的细胞膜,SDS-PAGE分离膜蛋白,液相色谱/电喷雾串联质谱分析(LC-MS/MS)结合生物信息学分析鉴定出316种非冗余蛋白质,其中152种(48.5%)被注释为膜蛋白或膜相关蛋白.通过肿瘤差异蛋白质组数据库(dbDEPD)搜索,发现在114个膜蛋白中有49种膜蛋白与其它肿瘤的发生发展密切相关,其中21个膜蛋白与肿瘤转移相关.进一步分析发现膜蛋白CD104、VDAC2、CD298和SLC25A3与同属头颈部肿瘤的口腔癌转移相关,提示这4个膜蛋白也可能是鼻咽癌潜在的转移相关蛋白.研究结果提供了一个鼻咽癌细胞5-8F包含中高丰度膜蛋白的数据库,为进一步研究头颈部肿瘤鼻咽癌癌变分子机理积累了有价值的资料.     

5-氮杂-2＇-脱氧胞苷对卵巢癌细胞系CP70顺铂耐药性的逆转作用

目的：探究5-氮杂-2＇-脱氧胞苷体外逆转卵巢癌铂类耐药细胞系CP70对顺铂的耐药性,并探讨与SOCS-2表达的关系。方法：免疫细胞化学和Western blot方法检测使用5-氮杂-2＇-脱氧胞苷处理细胞前后细胞内SOCS-2表达水平。MTT法检测单独使用5-氮杂-2＇-脱氧胞苷或顺铂及两药联合使用对CP70细胞的抑制作用。结果：两药联合处理CP70细胞后顺铂耐药逆转倍数为1.34、1.63、2.34,联合处理组的细胞中SOCS-2表达明显升高。结论：5-氮杂-2＇-脱氧胞苷可以部分逆转CP70细胞对顺铂的耐药性,且此作用可能与增加细胞的SOCS-2表达有关。     

锌_7-与镉_7-金属硫蛋白对羟自由基损伤大鼠红细胞膜保护作用的比较

用电子自旋共振自旋标记物氮氧自由基硬脂酸和马来酰亚胺标记大鼠红细胞膜脂和膜蛋白,测定膜脂流动性和膜蛋白构象改变,以硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化产物丙二醛含量．结果表明,锌7-与镉7-金属硫蛋白对羟自由基引起的膜脂流动性减低、脂质过氧化反应增强双膜蛋白构象改变有明显抑制作用,而且,前者的作用明显强于后者．     

2-甲氧基-4-羟基-5-乙酰基偶氮苯-4′-胂酸的合成及生物活性初探

本文通过丹皮酚与对氨基苯胂酸(阿散酸)进行偶联反应,合成了丹皮酚的偶氮化合物,即2-甲氧基-4-羟基-5-乙酰基偶氮苯-4′-胂酸(化合物4)。同时,对该化合物进行了结构表征,以及采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定不同浓度化合物4作用下不同时间对人肝癌细胞株HepG2细胞生长的抑制作用。初步研究显示化合物4能明显抑制人肝癌细胞株HepG2的生长,其作用呈剂量及时间依赖性,且明显强于丹皮酚和阿散酸的单独作用,表明其有潜在抗肿瘤活性。     

用N-3芘NEM标记巯基研究高铁卟啉化合物对红细胞膜蛋白的影响

N-(3芘)马来酰亚胺(N-3芘NEM)是一种特异标记蛋白质巯基的荧光探针,可通过荧光强度测定巯基含量。本文用不同浓度的高铁卟啉处理红细胞膜,再用N-3芘NEM标记,发现随浓度加大,巯基含量减少,与化学法测定结果一致,说明高铁卟啉可使膜蛋白巯基交联。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法做N-3芘NEM标记的红细胞膜,通过荧光扫描确定N-3芘NEM与红细胞膜区带1、2及3结合。     

膜蛋白巯基的氧化还原修饰对红细胞膜粘弹特性的影响

以正常人红细胞为样本,用巯基反应试剂对膜蛋白巯基进行氧化－还原修饰;用微管吸吮技术和生化分析,研究红细胞膜粘弹特性与膜蛋白巯基间的相关性。结果表明：在二酰胺（ｄｉａｍｉｄｅ）氧化修饰下,膜蛋白巯基含量降低,膜弹性膜量μ和粘性系数η均增加,而且随二酰胺浓度增加,它们的变化程度越大;在巯基乙醇还原修饰下,膜蛋白巯基含量增加,而弹性膜量μ和粘性系数η都降低;膜蛋白巯基含量与膜粘弹性系数μ和η呈负线性相关。根据实验结果,本文就引起红细胞膜粘弹特性变化的膜基团反应机制,进行了初步的分析和讨论     

电子顺磁共振技术在细胞膜研究中的应用

电子顺磁共振(EPR)技术具有高灵敏度、高分辨率的特性,通过自旋标记方法,可以用来研究膜蛋白质拓扑学、膜蛋白间相互作用、膜蛋白与磷脂膜相互作用过程中膜蛋白的结构变化以及细胞膜的流动性。在膜脂和膜蛋白的细胞生物学研究中具有广阔的应用前景。现对EPR技术在细胞膜研究中的应用进展做一综述。     

溶氧测定装置测定水果蔬菜中抗坏血酸含量的方法

TheMethodforMeasuringContentofAscorbicAcidinFruitsandVegetablesUsingEquipmentforDetermingDissoivedOxygenWANGJin－Shengu（DepartmentofBasicCourse,ShanxiAgriculturalUniversity,Tajgu030801）CHENGYU－Xiang（JinzhongMedicineSchool,Taigu030800）目前有多种测定抗坏血酸的方法,如2,4-二硝基苯肼法[2]、还原高铁法[8,9]、紫外吸收法[7]、Folin-酚试剂法[5]等。但在果蔬样品抗坏血酸含量的测定中,人们最常用的是2,6,二氯酚靛酚滴定法[3]。该方法设备简单,操作方便,但缺点是当样品液中有干扰色素时,会影…     

4-羟基苯并恶唑-2-酮对四氯化碳致小鼠急性肝损伤保护作用

日的研究4一羟基苯并恶唑-2-酮（4-hydroxy-2-benzoxazolone,HBOA）对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用,并探讨其疗效机制。方法采用腹腔注射四氯化碳（carbonte trachloride,cch）制备小鼠急性肝损伤模型,HBOA灌胃给药,检测小鼠血清中的乳酸脱氢酶（LDH）活性以及肝组织中过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量,并用免疫组化法观察肿瘤坏死因子（TNF-a）的表达情况。结果HBOA能明显降低CCh致急性肝损伤小鼠血清LDH活性,同时升高肝组织中CAT、GSH-Px的活性并降低肝组织中TNF-a的表达。结论HBOA对CCh所致小鼠急性肝损伤有一定的保护作用。     

不同产地生漆中漆酚清除自由基及构效关系的初步研究

为更好地开发和利用生漆资源,探寻生漆中主要有效成分漆酚的抗氧化性能,为生漆的深加工提供理论依据和参数。分别应用丙酮提取中国和越南生漆,对得到的漆酚粗提物中的漆酚含量进行测定,建立了阳性对照组Vc和二丁基羟基甲苯(BHT)基础的DPPH、ABTS及O2-.法,对提取物抗氧化性能进行测试;在此基础上,结合紫外光谱分析了中国和越南生漆中漆酚含量及结构差异性,并初步分析其抗氧化的构效关系。结果显示,各地生漆中漆酚提取物具有强的抗氧化活性:中国毛坝生漆提取物抗氧化活性最强,其次是越南红漆和中国小木漆;紫外光谱分析亦表明毛坝生漆中含有丰富的不饱和键可能与其较强的抗氧化性相关。     

β-环糊精包合挥发油和丹皮酚的工艺研究

以丹皮酚的包合率为指标,比较了饱和溶液法和研磨法的优劣,并采用四因素三水平的正交试验研究不同体积的水研磨,β-环糊精∶丹皮酚∶挥发油比例,研磨时间及无水乙醇冲洗量对丹皮酚包合率的影响.采用HPLC以丹皮酚含量为标准,测定包合物中丹皮酚的包合率.得到了β-环糊精包合挥发油和丹皮酚的最佳工艺条件.最佳包合工艺为:β-环糊精∶丹皮酚∶挥发油=8∶0.4∶0.5,β-环糊精∶水=1∶3,研磨2 h,用5 mL(加入0.5mL挥发油时)无水乙醇冲洗包合物.本方法包合率高,适合大量提取,可用于工业化生产.     

高活力5′-磷酸二酯酶制备及水解RNA的研究

目的:获得高活力5′-磷酸二酯酶液,提高核酸RNA酶解效率。方法:采用超滤和盐析技术对从麦芽根浸提液中纯化5′-磷酸二酯酶工艺进行研究,采用单因子试验法优化酶解工艺条件。结果:浸提液依次经过5万Da超滤膜浓缩、40%饱和度硫酸铵盐析、5万Da超滤膜脱盐后,酶活力可达1 500U/ml;第1次超滤膜透过液可作为浸提液循环使用,酶活力是水浸提的1.15倍;第2次超滤膜透过液浓缩5倍后,可回收56.46%硫酸铵,浓缩母液可按1∶2比例循环使用;在底物浓度5.8%、酶用量8%、反应时间2h条件下,RNA酶解率可达95%。结论:初步建立了适合工业化规模的核苷酸生产新工艺。     

酚-次氯酸钠显色法测定大鼠脑中游离氨-N含量

本文介绍一种用酚-次氯酸钠试剂直接测定动物组织样品中游离氨-N含量的方法,此法简便、灵敏、省时,最小检测量为0.05微克氨-N。酚-亚硝基铁氰化钠试剂:取酚0.6克、亚硝基铁氰化钠5毫克、加水至50毫升,放置24—48小时后使用。次氯酸钠试剂:Na_2HPO_4·12H_2O 1.79克、Na_3PO_4·12H_2O 1.9克、氢氧化钠0.5克、次氯酸钠原液1毫升,加水至50毫升,贮于棕色瓶内。硫酸铵标准液(1毫升=0.05     

铁缺乏及运动对大鼠红细胞膜圆二色谱、膜表面电荷及膜流动性的影响

采用圆二色谱、膜表面电荷及膜流动性指标测定了铁缺乏和运动大鼠红细胞膜的损伤变化。发现铁缺乏和运动两因素同时存在时红细胞膜蛋白的α－螺旋含量显著偏高,边缘缺铁运动组偏低。运动使红细胞膜表面电荷显著下降。反映膜脂质流动性的,值各实验组差异不显著。提示缺铁和运动所致膜损伤与膜蛋白氧化修饰或膜蛋白成分增减有关。     

老化红细胞肌醇磷脂代谢的探讨

本文用密度梯度离心法,将红细胞分成年轻及老化两部分,分别测定了膜磷脂、甘油二酯及磷酸肌醇的含量,蛋白激酶C在膜内及胞浆内的分布及其对膜蛋白的磷酸化。实验结果表明老化及年轻红细胞磷脂含量,除磷脂酰胆碱明显降低外,其他均无差异。老化红细胞甘油二酯含量低于(P<0.01)年轻者,而磷酸肌醇两者含量相似。老化红细胞膜内蛋白激酶C活性远比年轻者高,而在胞浆内活性则相反。说明老化红细胞膜蛋白激酶C活性增高,可使红细胞膜蛋白4.1、4.2、4.5和4.9进行磷酸化,这些膜蛋白与维持红细胞形态及功能有关,可能它们的磷酸化是老化红细胞变形性降低,脆性增加的因素之一。     

膜Ca~(2 )-Mg~(2 )-ATPase连续自动分析方法

目前,膜ATPase的活性测定主要是利用ATP再生系统,以及测定ATP水解所释放Pi的方法。比色测Pi的方法为Fiske所开创。Lacy改用抗坏血酸作还原剂,还原磷钼酸,提高了灵敏度。通常在中止酶反应,进行Pi比色测定之前,使用离心或过滤去除变性的酶蛋白。Klinc将酶水解产生的Pi透析到还原性试剂中,以进行Na~ -K~ -ATPase的自动分析。Arnold用表面活性剂溶解膜蛋白,省去过滤、离心或透析等步骤,进行膜ATPase的自动分析,具有简便、快速、灵敏度高、结果可靠等特点,本文基于Arnold的工作,全部使用国产仪器,用于红细胞膜Ca~(2 )Mg~(2 )-ATPase的分析。材料与方法 1、试剂 ATP(江门化工厂),Ouabain为Serva公司产品,其余均为国产分析纯试剂。     

细胞毒T淋巴细胞抗原-4的研究进展

细胞毒T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)是激活的T细胞表达的一种膜蛋白,属免疫球蛋白超家族成员,它通过与B7分子的结合来阻止共刺激信号的传递,抑制抗原特异性T淋巴细胞的增殖活化,起到抑制免疫反应及诱导免疫耐受的作用。CTLA-4在自身免疫病、过敏性疾病、感染、肿瘤及抗移植排斥等领域具有广阔的应用前景。简要综述了CTLA-4的基因、分子结构,及其与T细胞应答的关系。