OEP及卵黄浓度对蓝狐冻融精子质量的影响

人工采取 6只优质芬兰雄性蓝狐精液 ,利用不同OEP及卵黄含量的Tris 果糖 -柠檬酸钠稀释液稀释 ,制成细管冻精 ,透射电镜下观察精子冷冻前后质膜和顶体超微结构 ,荧光免疫方法检测不同培养时间冻融精子的质量。结果表明 ,蓝狐精子顶体外膜双层膜的厚度为 0 0 2 0 μm ,冷冻 -解冻过程中易发生质膜膨胀、顶体外膜融合现象。顶体产生的囊泡分两种类型 ,一种是体积较大的中空囊泡 ,平均直径为 1 2 5 μm。另一种是体积较小的实体囊泡 ,内充满顶体内容物 ,平均直径为 0 83μm ,两种囊泡的数量不定。OEP能有效抑制顶体囊泡形成 ,影响顶体囊泡类型、体积大小及囊泡数量 ,添加适宜剂量OEP能使顶体囊泡的体积明显缩小 ,囊泡的总数及中空囊泡的数量显著降低。蓝狐冻融精子质量与OEP及卵黄剂量有关 ,在卵黄存在的前提下 ,OEP有利于维持冻融过程中质膜 (5 6 3% )、顶体的完整性 (5 7 8% ) ,显著提高冻融精子活力 (5 4 7% )。在蓝狐精液稀释液中 ,OEP、卵黄的适宜含量分别为 1 %、 2 0 %     

冷冻—解冻猪精子的超微结构观察

自从50年代初Polge发现甘油有卓越的防冻作用以后,动物精液冷冻技术发展很快。现在,奶牛和羊冷冻精液已广泛应用于人工授精和体外受精中,效果与鲜精接近,而猪冷冻精液在人工授精后虽也能产仔,但妊娠率与每窝产仔数均下降(Johnson等,1981);体外受精率可达85％以上,但精子浓度需用5—6×10_7精子/ml,比鲜精用量提高25—100倍(Wang等,1991)。顶体形态正常精子的减少是造成冷冻精液受精率低的重要原因之一(Pursel,1979),用光镜不能清楚地观察顶体的形态变化,但运用电镜技术对猪冷冻-解冻精子的顶体形态的超微结构研究报道不多(Courtens等,1985;Hashizume,1990)。针对猪冷冻—解冻精子体内/体外受精能力降低的问题,我们用透射电镜对冷冻的猪精子解冻0 h及4 h后精子顶体与头部质膜的超微结构变化进行了观察。     

平衡时间、冷冻方法及解冻程序对马精液冷冻效果的影响

精液平衡、冷冻及解冻是冻精制作过程中三个必不可少的环节,对精液冷冻效果起着决定性作用。在马(Equus caballus)精子冷冻中针对这三个过程的研究较少,为进一步优化马精液冷冻方法,提高精液冻后质量,本研究比较不同平衡时间、冷冻方法及解冻程序对冻融后精子运动参数、质膜完整性及线粒体膜电势的影响。平衡120 min、180 min和240 min组冻融后精液活力及质膜完整性明显高于平衡0 min、45 min、90 min及8 h平衡组;距离液氮面2 cm和4 cm高度熏蒸冷冻获得了与程序冷冻仪冷冻法相似的冷冻效果;采用高温瞬时解冻法(75℃7 s和46℃20 s)比常规方法(37℃30 s)获得了更高的冻后精液活力(P0.05)。综合上述结果,在马精液冷冻过程中综合采用120~240 min平衡,距离液氮面2~4 cm熏蒸法和高温瞬时解冻法(75℃7s和46℃20 s)可获得更好的精液冷冻效果。     

不同甘油浓度与平衡时间对食蟹猴精液冷冻效果的影响

探讨了不同甘油浓度(3%、5%、7%、11%)和不同平衡时间(30、60、90、120min)对食蟹猴(Macaca fascicularis)精液冷冻效果的影响,以建立和优化食蟹猴精液冷冻的程序。参照TTE稀释液成分组成改良型TTE,冷冻前和解冻后均检测精子的活力、畸形率、质膜完整性、顶体完整率。结果显示,平衡时间为30min时精子的冷冻解冻后活力、复苏率均高于平衡时间90min和120min组,差异显著(P<0.05),比60min组稍好;甘油浓度为3%、5%组的精子冷冻解冻后活力及复苏率均高于甘油浓度11%组,差异显著(P<0.05),比7%组好;不同甘油浓度各组间以及不同平衡时间各组间畸形率、质膜完整性、顶体完整率差异不显著(P<0.05)。由此得出如下结论,在食蟹猴精液冷冻中,在改良TTE中加入3%~5%的甘油且平衡30min可以获得较好效果,精子冻后活率和复苏率达到45%和62%。     

滇南小耳猪精液的直接冷冻保存

目的建立滇南小耳猪精液冷冻保存方法,加速云南省特有小型猪种的小型化选育。方法利用脉冲电刺激模式诱导公猪输精管自助收缩排精。利用直接冷冻新技术（DFM）研究不同冷冻方案对精子的运动度、精子顶体完整性和体内授精胚胎发育能力的影响。结果在直接冷冻方法中,3%甘油防冻剂的作用下,60 s植冰时间和1.5 mm/s的冷冻降温参数对精子运动度保护良好,精子运动复苏率达到61.7%。但是,3%乙二醇虽然与甘油一样对精子的顶体完整性都有很好的保护作用,对精子运动度保护能力较差。此外,3%甘油、60 s植冰、1.5mm/s冷冻速度的直接冷冻的冻精解冻,移植到超数排卵的母猪子宫颈口实施人工授精,获得卵的受精和胚胎发育潜能尚可。结论玻璃管直接冷冻可以完成滇南小耳猪精子的冷冻保存。     

甘油浓度对蓝狐精子深低温冷冻保存的影响及冻融前后精子的超微结构

人工采取8只优质芬兰雄性蓝狐的精液,分别利用2％、4％、6％和8％甘油浓度的卵黄-Tris-果糖-柠檬酸钠稀释液进行稀释,制成细管冻精。在冻融后0、O．5、2、4、6h检测4种浓度组的精子运动度、质膜完整率、顶体完整率;并利用透射电镜观察冻融前后精子的超微结构变化。冻融后0h,4％甘油浓度组冻融精子的运动度、质膜完整率、顶体的完整率均最高(分别为41．8％、43．6％、48．4％),2％浓度组最低(分别为24．5％、27．6％、31．7％);随着检测时间延长,2％与4％组的精子特性差异显著,但2％、6％、8％3个组间差异不显著;6h时各组间精子的运动度均不超过10％,最高质膜完整率和顶体完整率分别为11．8％、12．7％。说明蓝狐精液稀释剂中甘油的适宜浓度应为4％,冻融后精子的活力维持时间较短。蓝狐精子冻融过程中质膜极易发生膨胀或断裂、顶体囊泡化或溃散,而质膜和顶体丢失现象较少。     

一种简单实用的猪颗粒冻精制作技术

本实验以年龄在2.5岁左右的长白种公猪的精液为材料,在比较了常用的Ⅰ号、Ⅱ号、Ⅲ号猪精液冷冻稀释液和Ⅰ号、Ⅱ号解冻液及冷冻———解冻程序对猪精液的冷冻效果后,依据解冻后精子的活力、质膜完整性等指标,发现:1、Ⅱ号冷冻稀释液的稀释效果(精子活力42.5±5.2精子弯尾率44.7±3.5)和Ⅱ号解冻液的解冻效果(精子活力43.8±2.6精子弯尾率36.2±4.3)明显较好;2、根据制作经验总结,发现了一种与以往资料上介绍的完全不同的猪精液冷冻颗粒制作方法,从而筛选出了一种简单实用的猪颗粒冻精制作技术。     

猪精子冷冻损伤研究进展

综述了猪冻存精子顶体、质膜和线粒体的形态学变化及其对精子受精能力的影响,同时分析了冻融精子中所发生的蛋白质、DNA等生物大分子的变化及其可能对冻存精子质量及受精能力的影响,指出冷冻保存过程对精子蛋白质、DNA等生物大分子质和量的影响是精子冷冻损伤的实质,应用先进的蛋白组学进行猪精子冷冻损伤机理研究,有助于深刻揭示冷冻损伤的分子机理,为推动猪精液冷冻保存技术研究取得突破性进展提供理论依据。     

几种冷冻稀释液与单胺类防冻剂对中缅树鼩精子冷冻存活率的影响

该文实验精子采自昆明地区经笼养驯化的树鼩(Tupaia belangeri),检测其冷冻前后运动度、顶体完整率以及检测部分冷冻精子的受精能力。实验一:选用8种已报道的冷冻稀释液TTE、TCG、TCF、TTG、BWW、BTS、DM、SR稀释鲜精,并添加0.4mol/LDMSO,4℃预冷平衡2h后,TTE、DM和SR稀释液的精子的运动度与鲜精无差别(P>0.05),其余处理组均显著下降(P<0.05)。冷冻复苏后,各组的运动度显著低于预冷平衡处理后的运动度(P<0.05);DM组的复苏运动度显著高于其他稀释液组(P<0.05),BWW组最低(P<0.05)。对于顶体完整率,与鲜精相比,4℃平衡2h后,TTE和DM组精子的顶体完整率显著高于BWW、BTS和SR组(P<0.05)。冷冻复苏后,DM组精子的顶体完整率显著高于其它(除了TTE)冷冻组(P<0.05)。实验二:在DM稀释液基础上分别添加4种浓度0.2、0.4、0.8和1.2mol/L的二甲基甲酰胺(DF)、甲酰胺(F)、二甲乙酰胺(DA)和乙酰胺(A)以及0.4mol/LDMSO,经过预冷平衡处理后,与鲜精相比,各防冻剂组的精子运动度没有下降(P>0.05);冷冻解冻后,各冷冻组精子的运动度显著低于预冷平衡处理后的精子运动度(P<0.05);0.8mol/LDF和0.4mol/LDMSO组精子的运动度显著高于其它冷冻组(P<0.05)。对于顶体完整率,预冷平衡处理后各高浓度组的比率显著下降;冷冻复苏后,0.4mol/LF和0.4mol/LDF组精子的顶体完整率相对较高。实验三,人工授精实验中,DM+0.8mol/LDF冷冻精子的受精率为16.7%,DM+0.4mol/LDMSO的受精率为50.0%。以上实验结果提示,含卵黄的非离子冷冻稀释液对树鼩精子冷冻保护效果好,但单胺类防冻剂的防冻效果还需进一步深入研究。     

圈养黑熊精液的冷冻保存

将采自23 头成年圈养黑熊的精液,分别用3 种稀释液(Ⅰ:Tris - 乳- 果- 卵;Ⅱ:柠- 葡- 蔗- 卵;Ⅲ:Tris - 柠- 果- 葡- 卵)稀释并在4℃ 下保存,通过检测精液在不同稀释液稀释条件下的保存时间,筛选出最适稀释液用于精液的冷冻保存;从精液解冻后精子的活率、活力、畸形率、顶体完整率4 个指标,分别从3种冷冻保护剂(甘油3%、3.5% 、4% )、两种冷冻方法(两步冷冻法和自动冷冻法)两个方面进行了比较试验。结果表明:精子活力在0.3 以上时,稀释液Ⅲ保存时间为175.42 ± 3.04 h,显著高于稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ(P ﹤0.01),稀释液Ⅱ保存时间也明显高于稀释液Ⅰ (P ﹤0.01);含3.5% 甘油浓度的稀释液解冻后精子活率(41.75 ± 3.46% )、活力(32.63 ±5.27% )和顶体完整率(85.62 ± 4.58% )显著高于其他两组(P ﹤0.01),并且精子畸形率(29.32 ± 8.22% )明显低于其他两组(35.95 ± 8.04% ,36.07 ±7.72% )(P ﹤0.01);采用自动冷冻法冷冻保存圈养黑熊精液,解冻后精子活率、活力和顶体完整率分别为41.75 ±3.46% 、32.63 ± 5.27%和85.62 ±4.58% ,都明显高于两步冷冻法(P ﹤0.01);解冻后畸形率为29.32 ± 8.22% ,明显低于两步冷冻法(P ﹤0.01)。     

长牡蛎精子超低温冷冻后超微结构损伤研究

采用程序降温仪分步降温冷冻保存长牡蛎（Crassostrea gigas）精液,并用扫描电镜、透射电镜研究了精子的超微结构损伤。超低温冷冻保存后长牡蛎精子的运动率、受精率及孵化率与鲜精无显著差异。鲜精中84.5%的精子形态结构正常,冻精中73%的精子形态结构正常。形态结构正常的精子表现为顶体、质膜、线粒体与鞭毛结构完整、染色质形状规则,顶体、线粒体及中心粒结构正常,鞭毛形态完整、微管结构清晰;形态结构异常的精子表现为顶体脱落、解体,精子头部质膜膨胀、破裂、染色质肿胀、破裂、解体,线粒体移位、脱落、膨胀,嵴退化或消失,鞭毛弯折、断裂,微管解聚。结果显示,以10% DMSO为抗冻保护剂,HBSS溶液为稀释液,1:4的稀释比例,添加海藻糖,采用分步降温法冷冻保存,对长牡蛎精子具有较好的抗冻保护作用,合适的冻存方法可以有效的保护太平洋牡蛎精子冷冻过程中结构损伤。研究有助于长牡蛎种质资源的收集保存及应用。     

精卵相互作用：诱发仓鼠精子顶体反应的部位

65只成年仓鼠经超排卵后,于排卵前人工授精。授精后6一7小时,收集输卵管壶腹部液(AF)、活动精子和卵子包括卵丘细胞(CM)基质和透明带(ZP),以相差显微镜检查精子顶体帽状态。在AF中有65.3％精子顶体帽发生改变;顶体反应(AR)率随着精子穿过CM而增加(73.7％);当精子到达ZP后,97.1％精子完成AR。25只仓鼠体外授精表明,获能精子在CM内游动或穿过CM时,顶体帽发生改变,可达到71.4％,但AR百分率甚低。当精子到达ZP后约30分钟完成AR。虽然单独的CM不能诱发体外仓鼠精子发生AR,但它可引起精子AR的早期阶段发生改变,并协同ZP促进获能精子完成AR。同样地,可溶性CM和ZP及其复合物可明显地激发体外仓鼠精子AR。但豚鼠ZP则无此作用。这些结果提示:AF是AR早期阶段的发生部位,而CM和ZP是体内仓鼠精子AR的主要部位;CM和ZP复合物是体外精子AR的诱导者。     

提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻方法

目的筛选一种既提高精子转染外源DNA效率,又保持解冻后精子活力的山羊精液冷冻—解冻方法。方法应用正交设计L9(34),因素分别为稀释液种类、稀释比例、降温时间和解冻液,每个因素选择3个水平,检测和比较解冻后精子转染外源DNA效率和精子活力。结果所选冷冻—解冻各因素对精液转染效率影响不显著[F(8,18)=1.032,P=0.449];平衡时间对冷冻—解冻活力影响极显著[F(2,24)=9.972,P=0.001],平衡1h极显著小于平衡2 h和4 h的精液活力(P=0.003,P=0.000),以平衡4 h最好。用筛选的冷冻—解冻方法处理精液,解冻后精子的活力极明显降低(P=0.002);生存指数降低,GOT释放量增加,菌落数减少,与鲜精相比差异显著(P=0.018;P=0.016;P=0.018);精子畸形率增加,顶体完整率降低,与鲜精相比差异不显著(P=0.494;P=0.084)。结论优化了提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻—解冻方法。     

不同渗透压的稀释液对猕猴精子低温冷冻保存的影响

以稀释液TTE(382mOsm/kg)为对照,研究了5种渗透压(688、389、329、166、43mOsm/kg)的TEST稀释液(TEST、mTEST1、mTEST2、mTEST3、mTEST4)在冷冻过程中对猕猴精子功能的影响。精液一步稀释于含甘油的防冻液中,甘油的终浓度为5%(v/v)。在冷冻前后分别检测精子的运动度和质膜完整性,后者用Hoechst33342和碘化丙锭双色标记流式细胞术分析。结果表明:冷冻之前,与鲜精相比,用TEST和mTEST4稀释的精子运动度和质膜完整性显著降低(P<0·001),其余组中除mTEST2稀释的精子质膜完整性显著降低(P<0·05)外,精子运动度无差异;冷冻复苏后,TTE、mTEST3和mTEST1冻存精子的运动度和质膜完整性最高,其次是mTEST2,TEST和mTEST4冷冻效果最差(P<0·05)。提示等渗、适当高渗或低渗的稀释液适合猕猴精子的冷冻保存;对精子产生高渗毒害作用是导致猕猴精子用TEST冷冻存活率低的主要原因。     

冻存液添加维生素B12,解冻液添加BSA及肝素对大熊猫精子的影响

大熊猫冻精的解冻活力一直徘徊在35%左右,顶体完整率低于40%,较大地影响着人工授精的成功率。本文通过在冻存液中添加维生素B12和在解冻液中添加BSA及肝素,以提高冻精活力和顶体完整率进行了实验研究,结果表明:(1)冻存液中添加维生素B121mg/ml,使精子顶体完整率从76.66%提高到83.34%(P<0.05);(2)选用美国Hyclone公司的M199、Ham's F-10液和Irving Scientific公司的两种Ham's F-10液(代号168、175)共4种解冻液,均添加5%的FBS进行比较实验,其中以Irving Scientific公司的Ham's F-10(175)对提高解冻精子质量效果最好,精子活力达到74.7%±2.706%,运动速度(SOP)为3±0.82(P<0.05);(3)解冻液中添加高浓度BSA对精子的运动速度有明显提高(P<0.05),而添加低浓度BSA对精子的影响不显著;(4)解冻液中添加肝素对精子活力及运动速度的影响均不明显(P>0.05)。     

中缅树鼩精子形态特征及冷冻损伤

树鼩作为一种新型的、接近灵长类的实验动物,在医学生物学上的应用受到越来越多的重视。精子的结构特性研究及冷冻后结构的完整性分析是精子生物学的主要内容,也有助于树鼩的实验室快速繁殖。该研究采用人工饲养的中缅树鼩(Tupaia belangeri chinensis),结果显示其睾丸占总体重的(1.05±0.07)%,总体积为(1.12±0.10)mL。附睾尾及输精管精子总量估计在2.2×107～8.8×107,其运动度和顶体完整率分别为(68.8±3.9)%和(90.0±2.1)%。利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对树鼩附睾精子的超微结构进行的观察和分析显示精子头部呈圆形或卵圆形;头部长度、宽度平均分别为6.65和5.82μm;精子尾部中段、主段、尾段和精子总长度平均分别为13.39、52.35、65.74和73.05μm;尾部中段的线粒体螺旋数量为48个,其轴丝结构为典型的"9+9+2"结构。冷冻解冻后的精子主要表现在顶体与质膜不完整、精子断裂、尾部扭曲和膨大。上述结果提示树鼩精子与其他哺乳动物精子的结构特征相似,但是精子大小和线粒体螺旋数目有明显的差别,且超微结构改变仍是冷冻精子运动和受精能力下降的主要原因。     

糖在猕猴精子低温冷冻保存过程中的作用

TTE或TEST防冻液在冻存猕猴精子时产生不同结果,其主要不同在于防冻液中糖成分的不同。本实验利用透射电镜技术检测这2种防冻液冻存的猕猴精子冷冻前后超微结构的变化,以说明糖在低温冻存过程中的作用。结果表明,冷冻复苏过程对精子结构产生了影响。TTE法低浊保存的猕猴精子的头部的质膜出现少许皱褶或泡化现象,但精子的顶体、核或是精子尾部的结构与鲜精的结构基本相似。猕猴精子经TEST法低温保存后,大部分精子结构则发生了明显的变化。精子膜、顶体和精子核明显泡化、损伤或破裂,精子尾部不能分辨出正常的超微结构。这提示,可能由于TTE防冻液中复杂的糖成分在降温／复苏过程对精子起到了较好的协同冷冻保护作用;而TEST防冻液中单一的糖成分不能完全保护精子避免低温损伤,低温保存过程破坏了精子的结构,并影响了复苏后精子体外存活能力与受精能力。     

鲱精子的形态及其活动

鲱(Clupea pallasii)的精子是由一个带圆形的头部(1.5μ×2.0μ)和中段(直径1μ)以及一根长约40μ的尾部组成的。以血球计测定:1立方毫米的新鲜精液(dry sperm)中含有精子0.8—1.0×10~8个。 鲱的成熟精子与许多其他海产动物的精子不同。当它与海水或任氏液接触时几乎是不活动状态,只是痉挛地振动着精体而已。虽以种种方法变更媒液的物     

蔗糖和海藻糖对水牛卵母细胞玻璃化冷冻保护效果的比较

本实验比较蔗糖或海藻糖作为非渗透性保护剂对水牛成熟卵母细胞冷冻效果的影响。将体外成熟的水牛卵母细胞随机分成对照组、蔗糖组、海藻糖组,研究玻璃化冷冻后的存活率、细胞骨架和孤雌激活后发育潜能的变化。结果表明:玻璃化冷冻中蔗糖组(89.68%)与海藻糖组(91.81%)的存活率差异不显著;冻融后的卵母细胞在细胞骨架方面的表现为:蔗糖组和海藻糖组的纺锤体结构、染色体形态与微丝分布正常率分别为34.69%、42.83%、39.13%和39.51%、49.43%、42.61%,两组间差异不显著(p0.05),但均明显低于对照组(66.40%,71.82%,76.18%,p0.01);在进一步研究发育潜能中发现,冻融后卵母细胞的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数在实验组中均无显著性差异(p0.05),但两组的卵裂率、囊胚率均显著低于对照组(p0.01)。综上所述,玻璃化冷冻时添加蔗糖或海藻糖作为非渗透性保护剂对水牛成熟卵母细胞的保护作用差异不明显,表明两者均可在冷冻时添加使用。     

稀释液中添加海藻糖对山羊精子功能和膜完整性的影响

选用5只年龄为3～4岁的波尔山羊公羊研究在稀释液中添加海藻糖对山羊精子功能和膜完整性的影响。山羊精子分别用含6.6 mmol/L、13.2 mmol/L、19.8 mmol/L、26.4 mmol/L、39.6 mmol/L、52.9 mmol/L、66.1mmol/L、79.3 mmol/L的不同海藻糖的Tris-柠檬酸-葡糖糖(TCG)稀释液(卵黄:18%;甘油:6%)稀释和冷冻。结果表明:39.6 mmol/L、52.9 mmol/L、66.1 mmol/L、79.3 mmol/L组降温后的精子活率显著(P<0.05)降低;52.9 mmol/L、66.1 mmol/L、79.3 mmol/L组降温后的精子畸形率和39.6 mmol/L组降温后的膨胀精子率显著(P<0.05)提高。26.4 mmol/L组和39.6 mmol/L组冻融后的精子活率显著(P<0.05)高于对照组;66.1mmol/L和79.3 mmol/L组冻融后的精子活率、畸形率分别显著(P<0.05)低于和高于对照组。19.8 mmol/L、26.4 mmol/L、39.6 mmol/L组冻融后精子获能率显著(P<0.05)低于对照组。39.6 mmol/L组冻融后顶体完整率和膨胀精子率显著(P<0.05)高于对照组,而66.1 mmol/L组和79.3 mmol/L组显著(P<0.05)低于对照组。39.6 mmol/L组的受胎率显著(P<0.05)高于对照组,而66.1mmol/L组和79.3 mmol/L组的受胎率显著(P<0.05)低于对照组。结果表明,在含18%的卵黄(v/v)、6%甘油(v/v)的TCG稀释液中,添加适宜浓度(26.4mmol/L和39.6 mmol/L)海藻糖,可显著提高山羊精子功能和膜的完整性。