条件性缺氧诱导因子-1α RNAi转基因小鼠模型的建立

缺氧诱导因子1a (hypoxia inducible factor-1 a, HIF-1 a)是细胞在缺氧等条件下稳定表达的具有转录活性的蛋白,通过与多种靶基因调控区的缺氧反应元件(hypoxia response element, HRE)结合, 调控靶基因表达, 使机体对缺氧、缺血等病理生理过程产生适应性反应。为从整体动物水平研究HIF-1 a的作用, 需要建立HIF-1 a相关遗传修饰小鼠。分别针对HIF-1 a mRNA序列的两个靶位点合成两对互补的寡核苷酸链, 构建可诱导的RNA干扰真核表达载体HIF-AB和HIF-CD。分别将CRE重组酶真核表达载体CRE-ERT2与HIF-AB或HIF-CD转染入RAW264.7细胞, 筛选得到稳定表达CRE-ERT2与HIF-AB, 或CRE-ERT2与HIF-CD的稳定细胞系。在用4-HT诱导去除上述细胞系中HIF-AB或HIF-CD所含的Neo基因后, 用CoCl2诱导HIF-1 a表达, 采用半定量RT-PCR检测HIF-AB或HIF-CD对HIF-1 a 基因表达的影响。结果发现干扰载体(HIF-AB和HIF-CD)对HIF-1 a mRNA序列的沉默效果分别为85%和72%。选择干扰效率较高的表达载体HIF-AB经显微注射获得HIF-1 a基因敲低小鼠模型, 经PCR以及测序验证获得2个转基因阳性小鼠(Founders, G0代)。G0代雄鼠与FVB/N雌鼠交配后获得2只F1代(first filial generation)转基因阳性小鼠, 经与EIIA-Cre转基因小鼠交配, 得到EIIA-Cre; HIFRNAiflox/+小鼠, RT-PCR结果显示, EIIA-Cre; HIFRNAiflox/+小鼠肝、肺、肾等组织的HIF-1 a mRNA水平明显降低, 分别约为正常对照的44%、38.2%和23.5%。该小鼠模型的建立为进一步研究HIF-1 a的功能及作用机制提供了新的手段。     

睾丸内注射pEGFP-N1体内转染精子并在山羊早期胚胎成功表达

目的探讨睾丸内注射法pEGFP-N1在精细胞的整合和在早期胚胎中表达.方法选择4头本地山羊,双侧睾丸注射不同剂量质粒DNA pEGFP-N1,注射后PCR和Southern杂交检测pEGEP-N1在精子中的整合.结果pEGFP-N1整合到精子基因组中,转染效率最高发生在注射后第40天,转染阳性率最高为81%;绿色荧光蛋白在精子及其体外受精的部分胚胎中表达,胚胎阳性率最高的达66.7%.结论通过睾丸内注射pEGFP-N1能整合进入精子基因组,并能通过体外受精在山羊早期胚胎中表达;睾丸内注射法可能是一种可行、简单并利于推广的制备转基因山羊的方法.     

提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻方法

目的筛选一种既提高精子转染外源DNA效率,又保持解冻后精子活力的山羊精液冷冻—解冻方法。方法应用正交设计L9(34),因素分别为稀释液种类、稀释比例、降温时间和解冻液,每个因素选择3个水平,检测和比较解冻后精子转染外源DNA效率和精子活力。结果所选冷冻—解冻各因素对精液转染效率影响不显著[F(8,18)=1.032,P=0.449];平衡时间对冷冻—解冻活力影响极显著[F(2,24)=9.972,P=0.001],平衡1h极显著小于平衡2 h和4 h的精液活力(P=0.003,P=0.000),以平衡4 h最好。用筛选的冷冻—解冻方法处理精液,解冻后精子的活力极明显降低(P=0.002);生存指数降低,GOT释放量增加,菌落数减少,与鲜精相比差异显著(P=0.018;P=0.016;P=0.018);精子畸形率增加,顶体完整率降低,与鲜精相比差异不显著(P=0.494;P=0.084)。结论优化了提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻—解冻方法。     

山羊精子结合外源DNA能力的年龄及品种依赖性

本文应用正交设计L16(44),优化精子和外源DNA处理条件;用建立的方法转染1-4岁川东白山羊和波南F1公羊、2岁波尔山羊和南江黄羊公羊共149只,用原位杂交法检测精子结合外源DNA的效率,比较不同品种、年龄的山羊(Capra hircus)精子结合外源DNA的能力。结果显示川东白山羊1岁时的阳性精子率为39.34%±13.76%,4岁时降为23.40%±19.37%,与1岁和2岁时相比,差异显著;南江黄羊的阳性精子率最高,波尔山羊最低;并筛选到一种山羊精子和外源DNA处理方法。表明实验山羊的精子结合外源DNA的能力有随着年龄的增长而减少的趋势,并表现出品种间差异。     

一种简单的人脐带间充质干细胞分离培养方法

目的 建立一种简单的人脐带间充质干细胞分离培养方法.方法 取新鲜脐带,剪成5 cm长的小段,直接剪碎为糊状,加入含10％胎牛血清的DMEM/F12在培养瓶中培养,光学显微镜下观察细胞的生长特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达,并检测其体外多向分化潜能.结果 运用不剥离血管组织、不用酶消化的组织贴块培养法可以从...     

小鼠破骨细胞诱导及成纤维生长因子受体表达检测

目的:检测成纤维生长因子受体(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)在小鼠破骨细胞中的表达情况,为探讨FGFRs时破骨细胞的直接调控作用奠定基础.方法:采用巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和破骨细胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-B ligand,RANKL)诱导小鼠骨髓单核细胞分化为破骨细胞.提取细胞总RNA后经逆转录获得小鼠破骨细胞cDNA,根据FGFRs基因编码区序列设计的引物进行PCR扩增并对PCR扩增产物进行测序.为进一步验证转录水平的结果,提取细胞总蛋白电泳后进行免疫印迹实验.结果:诱导5d后可见TRAP( )多核细胞出现,小鼠破骨细胞在转录水平和翻译水平均只可检测到FGFR1和FGFR3基因的表达产物.结论:M=CSF和RANKL可成功诱导出小鼠破骨细胞,FGFR1和FGFR3基因在小鼠破骨细胞中均有表达.     

冷冻对山羊精子转染外源DNA和体外制备转基因胚胎的影响

本实验将鲜精和冻精分别与地高锌标记的线形化的pEGFP-N，质粒孵育转染，用原位杂交方法检测转染效率；PCR和Southern Blotting检测精子与外源DNA的整合效率；与成熟卵母细胞体外受精，PCR检测阳性胚胎比率，用透射电镜技术、碘化丙锭和羟化荧光素双探针技术和单细胞电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术，观察精子冷冻前后的超微结构、精子质膜完整性和精子核DNA损伤的变化，研究冷冻对山羊（Caprahircus）精子转染内化外源DNA和体外制备转基因胚胎的影响及机理。结果表明，冻精显著提高了转染外源DNA的效率（81．60％±16．59％VS32．95％±2．93％，t=4．873，P=0．003；41．80％±6．26％vs27．89％±8．64％，t=2．634，P=0．039）。PCR和Southern Blotting检测表明外源DNA已经整合到精子基因组上。用冻精与成熟卵母细胞体外受精，体外受精穿透率和卵裂率显著低于鲜精组（24．19％±3．15％vs58．86％±3．73％，t=7．131，P〈0．001；11．83％±2．37％vs29．71±3．47％，t=4．302，P〈0．001），但体外生产的胚胎PCR阳性率比鲜精组显著提高（45．45％±10．87％VS24．44％±6．06％，t=1．750，P=0．013）。超微结构观察和双荧光探针检测都发现冷冻-解冻精子质膜完整性降低（8．34％±4．21％VS65．67％±6．46％，t=12．492，P〈0．001），SCGE显示冷冻极显著增加了精子彗尾长度和彗星细胞比例（42．67μm±4．56μmvs21．14／Lm±2．36μm，t=5．644，P=0．005；60．00％±4．00％vs17．37％±2．57％；t=15．787，P〈0．001）。冷冻-解冻可以提高山羊精子转染外源DNA的效率，冷冻破坏精子质膜完整性，解除质膜的阻碍作用，是提高外源DNA转染效率的一个主要原因[动物学报54（6）：1089-1097，2008]。     

骨形成蛋白4条件性RNA干扰小鼠的建立

为研究骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4, BMP4)在骨骼发育中的作用, 我们以含有LoxPneo的pBSK/U6载体为骨架, 构建小鼠BMP4条件性RNAi(conditional RNA interference), CRNA; 载体(BMP4CRNAi), 经KpnⅠ和AflⅢ双酶切获取针对bmp4并含neo基因的目的干扰片段, 纯化后的目的片段显微注射入0.5 d的FVB/NJ小鼠受精卵, 并植入同期发情的假孕母鼠中, 获取G0代转基因小鼠; 利用PCR对G0代转基因小鼠基因型进行鉴定, PCR阳性的小鼠与FVB/NJ小鼠交配, 最终获取稳定传代的BMP4CRNAi小鼠。稳定传代的BMP4^CRNAi小鼠与成骨和软骨前体细胞表达Cre的转基因小鼠(Col2a1-Cre)交配, 获取BMP4^Col2a1-CRNAi小鼠。分离BMP4Col2a1-CRNAi小鼠原代软骨细胞, 提取总RNA, 利用半定量RT-PCR检测RNA干扰效率。小鼠基因型鉴定结果表明：成功获得条件性RNAi转基因小鼠; BMP4干扰效率检测结果表明：在软骨细胞中BMP4的干扰效率为81％。以上结果表明, 我们成功制备了BMP4^CRNAi小鼠和BMP4^Col2a1-CRNAi小鼠, BMP4^CRNAi小鼠与不同Cre转基因小鼠交配, 可以研究BMP4在不同细胞、组织和器官的功能, BMP4^Col2a1-CRNAi小鼠的获得为研究BMP4在软骨发育中的作用提供了合适的动物模型。